La evidencia epidemiológica apunta bastante fuerte hacia una asociación entre el consumo de frutas y verduras y la prevención de varios tipos de cáncer, pero todavía existe debate y confusión sobre los mecanismos del efecto protector. Por muchos años, se mantuvo la hipótesis del antioxidante: frutas y verduras invariablemente contienen antioxidantes (vitaminas C y E, carotenoides, flavonoides, etc.): el daño al ácido desoxirribonucleico (DNA, por sus siglas en inglés) por radicales libres puede resultar en mutaciones y eventualmente en cáncer; los antioxidantes eliminan los radicales libres y previenen este daño; por lo tanto, los antioxidantes deben ser responsables de la protección contra el cáncer.
Existe bastante evidencia de que los antioxidantes o los alimentos ricos en antioxidantes, administrados a voluntarios en pruebas de intervención en efecto disminuyen el nivel de oxidación endógena al DNA medida en linfocitos y aumentan la resistencia de los linfocitos al daño oxidativo ex vivo. Pero el nivel de oxidación de bases ahora se reconoce como mucho menor (por órdenes de magnitud) de lo que se suponía y en algunos casos las especies reactivas de oxígeno (ROS, por sus siglas en inglés) están involucradas en la protección inmune y en las rutas de señalización celular, por lo que suprimirlas en exceso podría ser perjudicial. Nuestras defensas antioxidantes endógenas (catalasa y superóxido dismutasa, glutatión y enzimas asociadas, y moléculas como albúmina y ácido úrico con propiedades antioxidantes) son evidentemente capaces de mantener a las ROS y sus efectos en un nivel bajo, tolerable y tal vez deseable. Al mismo tiempo, pruebas clínicas a gran escala con suplementos antioxidantes y muerte o enfermedad como resultado final, han producido resultados poco alentadores, y los meta-análisis muestran una asociación positiva entre la suplementación con antioxidantes (al menos con dosis elevadas) y la mortalidad general. Así que la hipótesis antioxidante está siendo seriamente reconsiderada.
La modulación nutricional de los niveles de daño al DNA, como un posible biomarcador de carcinogénesis, ha sido extensamente revisada. Sin embargo, hay un consenso sobre que debería prestarse más atención a biomarcadores alternativos y mecanismos de quimioprevención. Las frutas y verduras no son solamente vehículos para los antioxidantes; estos contienen innumerables micronutrimentos, muchos de los cuales tienen propiedades antioxidantes, pero es claro que juegan muchos diferentes papeles en el metabolismo. Los micronutrimentos tienen efectos en las rutas de biotransformación y desintoxicación fase I y fase II, en las rutas de señalización celular y en los sistemas endógenos antioxidantes. En muchos estudios se ha identificado a los micronutrimentos como moduladores significativos de la expresión génica. Un atributo de los micronutrimentos que hasta hace algunos años no era considerado es la habilidad para modular las rutas de reparación del DNA.
Existen varias rutas de reparación: reenlace de quiebres (SB, por sus siglas en inglés) en cadenas individuales y en dobles cadenas, reparación de escisión de base (BER, por sus siglas en inglés) de bases oxidadas o alquiladas -alquilación es la transferencia de un grupo alquilo entre moléculas-, reparación de escisión de nucleótido (NER, por sus siglas en inglés) de aductos (parte del DNA unida covalentemente a un compuesto cancerígeno) voluminosos y entrecruzamientos intracadena distorsionadores de hélice, reparación de discordancias, reparación de entrecruzamientos intercadena, y es posible que cada una de ellas tenga diferentes modos de regulación.
Existen varios enfoques para medir la reparación y su inhibición o aumento por factores nutricionales o de otro tipo. Las investigaciones pueden realizarse en cultivo celular, en animales o en pruebas de intervención en humanos. Los niveles de expresión de los genes asociados a la reparación del DNA pueden ser medidos por ensayos de micromatriz (microarrays) o por reacción en cadena de polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR, por sus siglas en inglés). El fenotipo (actividad de enzima reparadora) es valorado por un ensayo de “desafío”, tratando células con un agente dañino y monitoreando la remoción del daño en el tiempo, o por un enfoque in vitro, incubando un extracto libre de células con un sustrato de DNA que contiene un daño específico.
Es debatible cual es la mejor medida de la capacidad de reparación, derivada del ensayo de “desafío”. Si se estudian puntos de tiempo a intervalos cercanos después del inicio de la incubación, la tasa inicial de remoción del daño puede ser estimada, pero esto dependerá probablemente del nivel de daño incidente, el cual es posible que varíe entre individuos (por ejemplo, como una función del estatus antioxidante). Un parámetro que toma esto en consideración es la vida media (t1/2)de remoción de daño, que también requiere de mediciones del daño en varios puntos de tiempo para estar seguro de estimar con precisión el punto medio. Lo que claramente no es muy informativo (pero que se emplea con frecuencia) es una medición individual del daño residual en un cierto tiempo después del daño incidente -usualmente un tiempo en donde la mayoría del daño ha sido reparado.
El ensayo cometa (un método simple para la medición de los quiebres de cadena (SBs) del DNA, basado en la relajación del superenrollamiento del DNA por quiebres y subsecuente extensión del DNA para formar una ‘cola’ bajo electroforesis se una con mucha frecuencia para monitorear el reenlace de los SBs por las células; también se aplica para la reparación de bases oxidadas, incorporando una digestión del DNA con formamidopirimidina DNA glicosilasa (FPG) o endonucleasa III para convertir las purinas o pirimidinas oxidadas, respectivamente, en SBs.
La alternativa al ensayo de “desafío”, el ensayo de reparación in vitro, toma varias formas; el sustrato puede ser un oligonucleótido o plásmido diseñado con una base alterada específica en la secuencia, siendo la actividad de reparación indicada por una muesca del DNA o la incorporación de un nucleótido etiquetado en un parte de reparación. Alternativamente, puede usarse el ensayo cometa, en el cual el sustrato está en la forma de nucleoides embebidos en agarosa, derivados por lisis de células tratadas con un agente dañador de DNA específico.
Modulación de la reparación del DNA por micronutrimentos en células cultivadas
El efecto de los carotenoides en la reparación de SB ha sido estudiado en células cultivadas. Se incubaron células Molt-17 (una linea celular de linfocitos humanos) con una solución 8 μM de β-caroteno, luteina o β-criptoxantina y se indujo daño al DNA con peróxido de hidrógeno (H2O2); se encontró que las células suplementadas con carotenoides mostraron un decremento en SBs en una incubación de 2 horas, mientras que las células control no lo hicieron. Este mismo grupo reportó que en un ensayo in vitro basado en la incorporación de un nucleótido etiquetado en un parche de reparación no mostró una estimulación detectable por carotenoides. En enfoque similar (monitoreado y reenlace de SBs) fue aplicado por otro grupo de estudio, utilizando linfocitos humanos incubados con β-caroteno o licopeno 2 μM; los carotenoides fueron capturados por las células, pero no tuvieron efecto en la tasa de reenlace.
Un grupo adicional de investigación monitoreó el reenlace de SB y la remoción de bases oxidadas (8-oxoguanina introducida por tratamiento con fotosensibilizador y luz visible) por lineas celulares humanas HeLa y Caco-2, incubadas con β-criptoxantina. Ambos tipos de reparación fueron aumentados a concentraciones 1 μM y 4 μM, no mucho más altas que las encontradas en el plasma humano. Adicionalmente, encontraron un aumento en la reparación in vitro en un sustrato de DNA nucleoide conteniendo 8-oxoguanina, indicando una mayor actividad de 8-oxoguanina DNA glicosilasa (hOGG1). No hubo un efecto detectable en las concentraciones de proteínas de reparación (por transferencia de tipo Western -Western blotting).
Células humanas Caco-2 y HepG2 así como fibroblastos de hámster chino linea V79 fueron preincubados con los flavonoides comunes quercetina, rutina o miricetina, a 50 μM antes de un tratamiento con H2O2 para inducir SB; la tasa de reenlace no cambió por ninguno de los flavonoides (50 μM es una alta concentración y se ha demostrado tanto que induce el daño al DNA como que protege contra el quiebre inducido por H2O2). En contraste, otro grupo ha reportado un incremento en la expresión del mRNA de hOGG1 después del tratamiento con H2O2, cuando células Caco-2 fueron preincubadas con quercetina 100 μM. Esta misma línea de células fueron sujeto de estudio por un tercer grupo, con extractos de Salvia sp. y sus principales constituyentes fenólicos, ácido rosmarínico y luteolina, así como el triterpenoide ácido ursólico. El grado de reenlace de SB después del tratamiento con H2O2 se incrementó por preincubación con extractos de salvia, ácido ursólico o luteolina, mientras que la reparación in vitro de 8-oxoguanina fue mejorada marginalmente. En células HepG2, quercetina 20 μM y sulforafano 10 μM no tuvieron efecto en la tasa de remoción de aductos causados por PhIP (una amino heterocíclica).
Los antioxidantes fenólico curcumina (10-100 μM) y silimarina (10-40 μM) incrementan la actividad de O6-metilguanina-DNA metiltransferasa (MGMT) en linfocitos humanos y lineas celulares tumorales, además de elevar el nivel del mRNA de MGMT. La MGMT se conoce como una enzima “suicida” que remueve el grupo metilo de O6-metilguanina, volviéndose alquilada e inactiva en el proceso; previamente se pensaba que era producida constitutivamente y no inducible.
El resveratrol (5-30 μM) inhibe la reparación de dobles quiebres de cadena (DSB, por sus siglas en inglés), tanto la recombinación homóloga (HR, por sus siglas en inglés) como el enlace o unión de extremos no homólogos (NHEJ, por sus siglas en inglés), vía las enzimas ATM/ATR y la ruta de señalización p53. Se cree que ATM minimiza la reparación tendiente a errores y la activación por resveratrol podría por tanto jugar un papel en la estabilización del genoma y la quimioprevención.
Más que agregar un fitoquímico, un grupo de investigación cultivó células HaCaT (queratinocitos humanos inmortalizados) en un estado de deficiencia de folato y encontró, además del incremento esperado en la incorporación errónea de uracilo, una menor capacidad para reparar SBs inducidas por luz solar simulada o H2O2.
Finalmente, los flavonoides oligoméricos totales (TOF, por sus siglas en inglés), obtenidos por extracción agua/acetona y precipitación mediada por cloroformo, y extractos de solventes orgánicos de la planta medicinal tradicional Acacia salicina (rica en micronutrimentos como taninos, flavonoides y cumarinas) indujeron la expresión de genes involucrados en BER y NER, así como rutas de defensa antioxidante, en células linfoblastoides humanas K562.
Es importante reconocer que muchos estudios de cultivo celular emplean concentraciones de fitoquímicos que son mucho mayores de lo que podrían alcanzar in vivo, o al menos en la sangre (alrededor de 1 μM). Las concentraciones más altas, sin embargo, son relevantes para una posible exposición de las células epiteliales del tracto gastrointestinal.
Con la prueba de dicho paquete de agentes dañadores del DNA y micronutrimentos, las rutas de reparación estudiadas, enfoques y concentraciones prácticas, es imposible llegar a conclusiones generales. Es importante estar al tanto de que los resultados aparentemente negativos podrían simplemente reflejar la incapacidad del compuesto de prueba para entrar en las células (o permanecer activo dentro de las mismas). Es por tanto recomendable, de ser posible, confirmar la presencia del compuesto dentro de las células. Sin embargo, cuando se observan los efectos, pueden ser de verdad convincentes.
Estudios animales sobre el efecto de los micronutrimentos en la reparación al DNA
Varios grupos han estudiado el efecto de la interrupción del metabolismo de 1 carbono en la estabilidad del DNA. Folato, colina y metionina interaccionan en esta ruta. Alimentando a ratas con una dieta deficiente en folato o metilos, el metabolismo de 1 carbono fue interrumpido y se encontró daño oxidativo en el DNA del cerebro. Comparado con las ratas control, hubo un incremento en las SBs del DNA y probablemente como una consecuencia, se incrementó la expresión de los genes de reparación del DNA, que codifican para AP endonucleasa 1 (Ape1) y DNA polimerasa β (Polb). De forma similar, otro grupo observó que la deficiencia de folato en ratas incrementa los niveles de 8-oxoguanina en linfocitos al tiempo que aumenta las cantidades de proteínas OGG1 y MGMT en el hígado, pero no en el colon. En un reporte temprano, se demostró que una dieta deficiente en metionina y cisteina disminuye significativamente los niveles de proteína MGMT en el hígado de ratón, pero no en riñón, pulmón, testículos y cerebro. Estas observaciones indican que distintos tejidos pueden responder de manera diferente a las deficiencias de micronutrimentos o al aumento en el daño al DNA.
Con frecuencia, una combinación de deficiencia de colina y folato con una dieta baja en metionina se adopta en estudios animales. En un papel temprano se encontró un incremento en la actividad de poli-ADP-ribosa polimerasa (PARP) en el hígado de ratas con dicha dieta. La polimerización de ADP-ribosa es una respuesta temprana al daño al DNA, aparentemente estabilizando los SBs y reclutando hacia el sitio otras proteínas asociadas a la reparación. Se ha confirmado el incremento en la actividad de PARP y también se ha reportado un incremento substancial en la relación de desoxiuridina trifosfato a desoxigenara trifosfato (dUTP/dTTP) en la poza del precursor de DNA, consistente con un bloqueo en la biosíntesis de novo, dependiente de folato, de timidilato, lo que lleva a la mala incorporación del uracilo. La uracilo DNA glicosilasa remueve la base mal incorporada, pero un ciclo de reparación fútil podría derivar en la reincorporación de uracilo, y un subsecuente incremento en los SBs asociados a la reparación.
La poli-ADP-ribosa es sintetizada a partir de ADP-ribosa donada por nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) y el precursor de NAD es la vitamina B3 (niacina o nicotinamida). Se ha encontrado que la deficiencia crónica de niacina es difícil de mantener, con un efecto variable en la actividad de PARP. Se ha reportado un decremento en las concentraciones de poli-ADP-ribosa asociadas con una deficiencia leve de niacina. Sin embargo, después de la exposición crónica a una dieta baja en metionina, folato y colina, combinada con deficiencia de niacina, las ratas mostraron un decremento en la concentración de NAD y actividad reducida en PARP en el hígado, así como una alta incidencia de hepatocarcinomas.
Se ha estudiado el efecto de una deficiencia marginal de cinc (común en humanos), encontrándose que la deficiencia severa o marginal de cinc en ratas incrementó el estrés oxidativo, aumentó los SB del DNA en los leucocitos así como los niveles de proteína OGG1. Sorprendentemente, aunque la proteína PARP tiene dos dedos de cinc, su concentración no fue afectada. En un estudio subsecuente, tanto los niveles de mRNA como de proteína PARP se incrementaron en la próstata de ratas sometidas a una deficiencia marginal de cinc, y en combinación con el ejercicio crónico hubo un incremento en la oxidación del DNA.
Las actividades de PARP así como de la DNA polimerasa β y de la DNA ligasa, tres enzimas inducidas en el hígado de rata por tratamiento con aflatoxina B1 fueron más más altas en las ratas deficiencias en vitamina A o cobre y disminuyeron cuando recibieron suplementación.
Cambiando de las dietas deficientes en micronutrimentos a suplementación de una dieta normal, en una serie de experimentos un grupo de ratas recibió suplementación por varias semanas con una mezcla de nicotinamida, cinc y carotenoides, sometidas a irradiación ionizante de cuerpo completo y 3 horas después, el DNA del esplenocito fue analizado para determinar el daño residual al DNA (SB sencillos o dobles) utilizando elución alcalina y neutral; la reparación tanto de los SB sencillos como dobles fue aumentada, en comparación con los animales control. Otro grupo encontró que en ratas suplementadas con el flavonoide glicósido rutina, el rendimiento de los quiebres de DNA inducidos por aflatoxina B1 o N-nitrosodimetilamina en el hígado habían disminuido y los incrementos en las actividades de PARP, DNA polimerasa β y DNA ligasa inducidos por el carcinógeno fueron revertidos, una indicación temprana del efecto de los micronutrimentos no esenciales en los niveles de daño al DNA, aunque no queda claro si esto involucra un efecto directo en la reparación.
Más recientemente, se ha dado énfasis en el efecto de la suplementación con micronutrimentos en la expresión de genes que codifican proteínas asociadas a la reparación. En un estudio, los ratones fueron alimentados con una dieta que contenía ácido elágico (un polifenol encontrado en muchas bayas) o moras, fresas o frambuesas deshidratadas. El ácido elágico y la frambuesa tuvieron efectos particularmente fuertes, incrementando los niveles de Xpa, Ercc5 y Dnl3 (DNA ligasa III) de 3 8 veces. Las proantocianidinas de semillas de uva administradas a ratones incrementaron la expresión de Xpa, Xpc, Ddb2 y Rpa1 (genes para proteínas involucradas en NER). Los ratones C57B1/6J alimentados con una dieta con 8% de extracto de durazno o nectarina (rico en vitaminas C y A, niacina, potasio y compuestos polifenólicos) por 14 semanas mostraron un incremento significativo en la actividad de incisión de OGG1 en extractos nucleares de hígado, comparados con los ratones control, mientras que el extracto mitocondrial de hígado mostró un incremento significativo en la actividad de incisión solamente después de la suplementación con extracto de nectarina. En el mismo estudio, la suplementación con extracto de nectarina y durazno resultó en una disminución significativa de la expresión de Xpa y Tdg, mientras que Nthl1, el gen responsable de la remoción de aductos de formamidopirimidina (FAPY, por sus siglas en inglés) del DNA fue estimulado en el hígado del ratón.
Se ha medido la actividad de NER con el ensayo in vitro basado en el ensayo cometa, en extractos de tejido colónico de lechones. El efecto de una dieta materna rica en antioxidantes y otros micronutrimentos (taurina, carnitina, acetato de tocoferol y flavonoides) en la respuesta de los lechones a una inyección de hierro inductora de estrés oxidativo fue sometido a prueba. Los animales estresados mostraron un decremento en la actividad NER, comparados con los controles, y esto fue parcialmente revertido por la suplementación con micronutrimentos. Observaciones más recientes, utilizando el mismo modelo animal pero observando el hipocampo, mostraron que la suplementación protegió a los lechones contra los efectos del estrés oxidativo severo causado al nacer. Los niveles de 8-oxoguanina fueron significativamente más bajos y la actividad BER inicial fue mayor en los animales suplementados, en comparación con los controles.
En conjunto, la modulación experimental de la reparación del DNA en animales parece ser bastante informativa. Las dietas deficientes generalmente tienden a incrementar el daño al DNA y posiblemente como resultado deriven en un incremento en la actividad de reparación del DNA. Sin embargo, en ocasiones se ha visto una disminución en la actividad de reparación, lo que podría entonces ser la causa más que la consecuencia del incremento en el daño al DNA. Las dietas suplementadas principalmente mejoran la reparación del DNA y resultan en una disminución en los niveles del daño al DNA. La belleza de los estudios animales es que las dietas son simplemente alteradas o suplementadas con micronutrimentos, de manera que los animales absorben los micronutrimentos de manera natural, incrementando el valor de las observaciones in vivo. Adicionalmente, la ventaja de un modelo animal es que los órganos de interés pueden se estudiados en gran detalle, más que teniendo acceso solamente a células sanguíneas o a un tejido sustituto. No obstante, hay puntos importantes cuando se extrapolan los datos de animales a humanos; aunque los genes de reparación del DNA están altamente conservados entre los eucariotas, existen claras diferencias en ls organización y regulación de la reparación entre las especies, y por supuesto, existen también diferencias substanciales en la absorción y el metabolismo de xenobióticos, incluyendo micronutrimentos, entre los mamíferos.
Evidencia de pruebas de intervención en humanos sobre la influencia de los micronutrimentos en la reparación del DNA
Existen múltiples reportes sobre la reparación del DNA en humanos, estudiada a través de pruebas de intervención con micronutrimentos individuales, suplementos con una fruta o verdura o con dietas completas, y con dosis únicas o periodos de suplementación de una a varias semanas. Se toman muestras de sangre (se aíslan los linfocitos) antes y después de la suplementación y se realizan ensayos de reparación ex vivo. Con frecuencia la prueba incluye un grupo paralelo de control que no recibe suplemento (o recibe un placebo); un diseño alternativo es la prueba cruzada, en la cual todos los sujetos reciben los mismos suplementos, dosis y/o placebo, preferiblemente en orden diferente, lo que minimiza la oportunidad de lo que se conoce como ‘efectos de periodo’, que son cambios con el tiempo que no están relacionados con la intervención sino a otro factor no controlado, y hace que cada sujeto actúe como su propio control.
La forma más simple de reparación del DNA medida en estas pruebas es el reenlace de SBs inducidos por H2O2. Generalmente se encuentra que esto es muy lento, tomando hasta 24 horas para completarse, comparada con el rápido reenlace visto en la mayoría de las células cultivadas. La suplementación con vitamina C, β-caroteno, licopeno (pero no luteina) o zanahorias aparentemente aceleraron el proceso de reenlace. Sin embargo, la interpretación de estos resultados es complicada por el hecho de que los linfocitos aislados frescos sufren estrés oxidativo y el subsecuente daño al DNA, por la súbita exposición al oxígeno atmosférico. Se ha reportado un incremento en los SBs en linfocitos, sin tratamiento con H2O2, durando algunas horas después del aislamiento; y este incremento transitorio fue menos pronunciado en linfocitos tomados después de la suplementación con carotenoides. Parece ser que el lento reenlace aparente de los SBs inducidos por H2O2 podría ser una confluencia de la reparación del daño inducido y la introducción de daño adicional por exposición al oxígeno, y el efecto aparente de los carotenoides podría ser, de hecho, simplemente una protección antioxidante contra el daño adicional más que una mejora en la reparación.
La BER ha sido estudiada in vitro con un sustrato de DNA conteniendo 8-oxoguanina en varias pruebas con humanos, con resultados variados. Se reportaron incrementos en la actividad de OGG1 después de administrar coenzima Q10, vitamina C de liberación prolongada (pero no con las cápsulas convencionales de vitamina C), zanahorias (pero no con carotenos, vitamina C o mandarinas), kiwi y una dieta alta en frutas y verduras. No se registro efecto por brócoli o un cóctel de selenio, retinol, β-caroteno, vitamina C y vitamina E. Después de una suplementación con folato, se observó una disminución pero solamente en individuos que eran relativamente deficientes en folato.
La NER es mucho menos medida que la BER. Al suplementar con moras y jugo de manzana, no se ha reportado efecto en la NER (con un sustrato conteniendo aductos voluminosos), excepto que los individuos que portan 1 o más alelos de baja actividad para XPC-K939Q y/o RAD23B-A249V mostraron un incremento por la intervención. Al medir NER en un sustrato dañado por UV se encontró un decremento en los sujetos que tomaban una dieta rica en frutas y verduras o un suplemento de kiwi.
En varios estudios se ha estudiado la expresión de una variedad de genes asociados a la reparación del DNA. Un grupo reporta una tendencia general para un incremento de expresión después de una dieta rica en flavonoides, y los juegos de genes de reparación del DNA fueron estimulados después de una dieta rica en frutas y verduras o suplementación con kiwi, mientras que otros grupos no encontraron un efecto en la expresión de hOGG1 y otros genes de reparación. Un grupo adicional de investigadores estudió las concentraciones de proteínas y encontró, en pacientes de cáncer de mama que recibían tamoxifeno, un incremento en la cantidad de PARP después de la suplementación con coenzima Q10, riboflavina y niacina. Sin embargo, vale la pena señalar que la medición de los niveles del mRNA o la proteína no es necesariamente una buena guía de la actividad enzimática. Un alto nivel de mRNA no implica siempre más producción de proteína, y más proteína no siempre resulta en mayor actividad enzimática, dado que modificaciones post-traduccionales (entre otros modificadores de la estructura proteínica) podrían afectar la actividad enzimática. De hecho, en un estudio cuidadoso se midió tanto la expresión del gen hOOG1 como la actividad enzimática en un grupo de sujetos humanos y se encontró solamente una correlación pobre entre ellas.
Hasta hace poco tiempo había un interés muy limitado en la regulación de la reparación del DNA humano por factores exógenos y se asumía generalmente que era poco probable que funciones tan importantes como la reparación del DNA fueran fácilmente afectadas por la nutrición. Sin embargo, los varios modos de reparación muestran una variación interindividual bastante extensa y es poco probable que esto se debe solamente a polimorfismos genéticos. Los diferentes niveles de exposición a agentes dañadores del DNA en el ambiente podrían ser responsables por alguna parte de la variación, si las enzimas de reparación del DNA son inducidas por sus substratos, pero es un hecho que las diferencias en la nutrición individual podrían contribuir también.
Mientras ciertos estudios muestran observaciones similares en animales y humanos, otros muestran datos contrastantes o efectos que se observan solamente en ciertas subpoblaciones con un fondo genético específico. Adicionalmente, mientras los animales de laboratorio son generalmente consanguíneos, los humanos son surtidos diversos de varios millones de polimorfismos genéticos, lo que contribuye a la dificultad de discernir posibles efectos de los micronutrimentos en la reparación del DNA.
Una limitación adicional de los estudios humanos es que generalmente solamente están disponibles leucocitos para los estudios y que el supuesto de que este es un substituto confiable para los verdaderos tejidos diana de cáncer es conveniente pero no bien fundamentado. Se requieren estudios en donde se midan las tasas de reparación en los pacientes de cáncer, observando tanto el tumor como el tejido normal y en linfocitos, además de leucocitos. Actualmente se están desarrollando ensayos de reparación in vitro apropiados para su aplicación en biopsias de tejidos.
Papel de la epigenética en la modulación de la reparación del DNA
Los estudios epidemiológicos proporcionan evidencia de que la dieta, incluyendo la suplementación con micronutrimentos, puede tener efectos profundos en el nivel de daño al DNA y su remoción. Aunque las rutas celulares y moleculares por las cuales los nutrimentos afectan la expresión génica o la actividad enzimática de los genes de reparación del DNA no se comprenden del todo, los procesos epigenéticos (cambios en la expresión génica y el fenotipo sin una alteración correspondiente en la secuencia del DNA) han emergido como un mecanismo plausible. La metilación del DNA es actualmente la modificación epigenética más ampliamente estudiada, apareciendo principalmente como 5-metilcitosina en los dinucleótidos CpG. Las secuencias ricas en CpG (islas CpG o CGI, por sus siglas en inglés) se encuentran principalmente en las regiones promotoras de los genes y están normalmente no metiladas en los genes expresados. La hipermetilación de las CGI ha estado ligada con el silenciado transcripcional de los genes asociados, mientras que generalmente se piensa que la hipometilación aumenta la expresión génica. Mientras algunas marcas epigenéticas son establecidas durante el desarrollo embriónico y fetal y permanecen estables durante la vida adulta, existe evidencia creciente de que las exposiciones ambientales (dieta, estilo de vida, contaminación del aire y metales pesados, entre otros) pueden cambiar el estatus de metilación de los promotores génicos, modificando su expresión y finalmente contribuyendo a la disfunción celular.
Existen pocos estudios de los posibles lazos entre los cambios en los patrones de metilación del DNA de los genes de reparación de DNA causados por micronutrimentos y cambios en la expresión génica. Se ha reportado que el polifenol del té verde epigalocatequina-3-galato (EGCGI revierte la hipermetilación del promotor génico de MGMT y MLH1 en células de cáncer esofágico humano, acompañada por una reexpresión de dichos genes. El mismo grupo reportó que la isoflavona genisteina tiene un efecto similar.
Como se menciona arriba, estudiar la expresión génica no necesariamente da alguna indicación de la actividad enzimática. Por tanto, un grupo de investigadores estudió recientemente los cambios en la metilación en los genes asociados a BER y su efecto en la actividad de incisión de BER, valorada por un ensayo de reparación in vitro basado en el ensayo cometa. Este es el primer reporte de un incremento significativo en la metilación del promotor génico Ogg1 con el envejecimiento del cerebro de ratón y, como una posible consecuencia, un decremento significativo en la expresión de Ogg1 en los ratones más viejos, así como una actividad BER significativamente reducida. Adicionalmente, concerniente al efecto modulador de los micronutrimentos, se ha observado recientemente que la suplementación materna con antioxidantes modula el efecto del estrés oxidativo en la vida temprana en la metilación y expresión del promotor génico APE1 así como en la actividad BER en el hipocampo de lechones. Actualmente, el mismo grupo está estudiando otros tejidos en paralelo al cerebro, dado que la reparación del DNA podría ser afectada diferentemente en tejidos post-mitóticos y mitóticos debido al envejecimiento así como a la nutrición. No obstante, se ha demostrado que las exposiciones ambientales, incluyendo la suplementación con micronutrimentos, cambian el estatus de metilación de los genes que codifican las enzimas de reparación del DNA, alterando su expresión y modulando la capacidad de reparación del DNA y la susceptibilidad al daño oxidativo al DNA.
Influencias en la capacidad de reparación del DNA
Parece ser que un individuo tiene una capacidad de reparación intrínseca característica, al menos como lo indica la correlación observada entre las mediciones realizadas con varias semanas de separación. Desconocemos el grado de variación intraindividual a una escala de largo plazo. Parte de la variación interindividual puede ser determinada genéticamente. Un valor de la fracción de recombinación R2 de 0.4 podría implicar que el 40% de la variación de persona a persona se explica por una capacidad de reparación intrínseca (una tasa de reparación característica en cada persona, representando una predisposición genética, junto con otras influencias tales como estilo de vida). La variación remanente es debida a la variación diaria en la exposición ambiental, salud general, dieta y ejercicio, además de la variación experimental potencialmente medible. Existe evidencia creciente, a partir de cultivos celulares, estudios en animales y en humanos, que la reparación del DNA puede en efecto estar modulada por factores nutricionales, específicamente los micronutrimentos.
Las diferencias individuales en la capacidad de reparación intrínseca se conocen como indicadores probables de susceptibilidad al cáncer, dado que aquellos con una mayor capacidad de reparación deberían reparar el daño más rápidamente y por tanto disminuir la oportunidad de que el daño sin reparar esté presente al momento que la célula replica su DNA, resultando en una posible mutación. Pero es posible, por otro lado, que una alta capacidad de reparación refleje un alto nivel de exposición a agentes dañadores del DNA, si la reparación del DNA es inducible por su sustrato. La evidencia de esto es inconsistente: la exposición ocupacional y/o de estilo de vida a genotoxinas está algunas veces asociada con un incremento en la capacidad de reparación, algunas veces con una disminución y en otras no hay efecto. Generalmente, en los reportes publicados, si se observa un cambio en la actividad de reparación, es un incremento; pero este no es invariablemente el caso. En resumen, en el momento actual podemos decir que un incremento observado en la actividad de reparación, ya sea como una respuesta inducida a la presencia del daño al DNA o como una consecuencia de la estimulación por micronutrimentos, por ejemplo, es posiblemente benéfica para el organismo. Sin embargo, todavía es dudoso si la capacidad de reparación del DNA puede identificarse como un marcador de riesgo individual al cáncer.
Es posible que diferentes rutas de reparación tengan diferentes modos de regulación. BER es esencial para tratar con la inevitable presencia de daño por oxidación causado por ROS en el cuerpo y se asume que las enzimas son constitutivas. En contraste, NER trata con el daño causado por agentes que no están invariablemente presentes, tales como UV en la luz solar o los mutágenos alimentarios, por lo que es factible que sea un proceso inducible (facultativo). Evidencia circunstancial de esto proviene de la aparentemente mucho mayor variabilidad interindividual en NER del daño UV (unas a7 veces más alta y más baja) comparada con BER de 8-oxoguanina (unas 3 veces), medida en linfocitos con el ensayo de reparación in vitro cometa. Podría permitirse una explicación de los efectos contrastantes de la dieta alta en frutas y verduras en BER y NER, como se ha encontrado en la Prueba de Antioxidantes en Oslo (OAT, por sus siglas en inglés); podemos especular que esta dieta podría disminuir la exposición a químicos aductores a tal grado (por aceleración de su metabolismo y excreción, por ejemplo) que la ruta NER es inhibida.
La mayoría, aunque no todas las pruebas de suplementación en humanos descritas arriba fueron realizadas en indivudos sanos. Varias enfermedades están asociadas con inflamación y estrés oxidativo y, en consecuencia, muestran niveles elevados de daño oxidativo al DNA. Existe evidencia reciente de que un estado de enfermedad puede afectar la capacidad para reparar el DNA, y es posible que la respuesta a factores nutricionales pudiera alterarse. Indudablemente, es más simple estudiar individuos sanos, evitando el nivel extra de complejidad que representa la enfermedad; pero el conocimiento a nivel individual de la reparación del DNA y sensibilidad a factores nutricionales podría bien jugar un papel importante en la definición de un régimen de tratamiento, particularmente, por supuesto, en el caso de radioterapia y quimioterapia del cáncer, en donde el daño al DNA de las células cancerosas es el principal modo de acción.
Aunque no son necesariamente no saludables, podría esperarse que los individuos con un estatus antioxidante bajo (niveles relativamente bajos de antioxidantes dietarios en plasma, como resultado de una dieta pobre en frutas y verduras)respondan más fuertemente a los suplementos antioxidantes, ya sea que el punto final examinado sea el daño oxidativo de biomoléculas como el DNA o procesos inducibles incluyendo la reparación del DNA. La idea de estudiar sujetos que sufren de estrés oxidativo a fin de maximizar el efecto de la suplementación ya se ha discutido, pero no se ha examinado rigurosamente.
En estudios animales o humanos, es inusual encontrar intentos de establecer si existen relaciones dosis-efecto. Esto es ligeramente más común en cultivo celular. Hay unos cuantos reportes que muestran una clara respuesta a la dosis con diferentes puntos finales experimentales, y en dosis cercanas a las alcanzables in vivo. Por otro lado, diferentes dosis de kiwi han mostrado un efecto claro en BER, pero sin signo de una relación dosis-respuesta.
La falta de correspondencia entre la expresión génica de reparación del DNA y la actividad enzimática no es sorprendente y no es única del campo de reparación del DNA. La cantidad de una proteína particular presente en una célula depende no solamente de la tasa de transcripción y traducción, sino también de la tasa de renovación (acreción y degradación), y la actividad de una enzima no está simplemente relacionada a la cantidad de proteína sino que es afectada por la presencia de varios cofactores. La medición de los niveles de mRNA puede por supuesto dar valiosa información, pero para comparar fenotipos, no hay substituto para la medición directa de las actividades enzimáticas.
En conclusión y teniendo en cuenta un posible sesgo contra la publicación de efectos nulos, existen suficientes estudios que muestran efectos positivos o negativos de los micronutrimentos (o frutas/verduras) en la reparación del DNA para tener confianza en que la modulación nutricional de este proceso es real y de significado biológico. Aunque no comprendemos del todo las implicaciones de, por ejemplo, los efectos opuestos en BER y NER en las mismas muestras de linfocitos, es razonable especular que la regulación de la reparación puede adicionarse a la lista de procesos biológicos que son influenciados por lo que comemos y, específicamente, que esto podría formar parte de la explicación de los efectos preventivos del cáncer por muchos alimentos de origen vegetal. Las investigaciones futuras en este campo podrían enfocarse en elucidar los mecanismos subyacentes de la modulación nutricional de la reparación del DNA, estudiando la regulación redox así como la epigenética de las rutas de reparación del DNA, en adición a los cambios en la expresión génica.
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