Nutriomas y prevención del daño al genoma

El daño al ácido desoxirribonucleico (DNA, por sus siglas en inglés) a nivel de la secuencia de bases, el epigenoma y el cromosoma, es la causa fundamental de enfermedades del desarrollo y degenerativas (incluyendo el envejecimiento acelerado) y es prospectivamente predictivo de estas condiciones. Cientos de genes están involucrados en el mantenimiento de la integridad del genoma y existe una gran variación entre individuos con respecto a polimorfismos comunes que impactan la actividad de estas enzimas.

Las proteínas codificadas por aquellos genes requeridos para la replicación del DNA, la reparación del DNA o la desintoxicación de genotoxinas potenciales, dependen de cofactores esenciales que son obtenidos de la dieta, para una función óptima. Por ejemplo:

Vitamina C, vitamina E y los polifenoles antioxidantes (como el ácido cafeico) tienen un papel en la prevención de la oxidación del DNA y la oxidación de lípidos. Su deficiencia incrementa el nivel de linea base de los quiebres en la cadena del DNA, rompimiento de cromosomas y lesiones oxidativas al DNA, así como aductos de peróxido de lípidos en el DNA.

Folato y las vitaminas B2, B6 y B12 tienen un papel en el mantenimiento de la metilación del DNA; la síntesis de 2′-desoxitimidina 5′-monofosfato (dTMP, por sus siglas en inglés) a partir de 2′-desoxiuridina 5′-monofosfato (dUMP, por sus siglas en inglés) y el reciclado eficiente del folato. Su deficiencia provoca la mala incorporación de uracilo en el DNA, incremento en las rupturas de cromosomas y la hipometilación del DNA.

Niacina es requerida como sustrato para la poli(ADP-ribosa)polimerasa (PARP), la cual está involucrada en la separación y reunión del DNA y el mantenimiento de la longitud de los telómeros. Su deficiencia incrementa el nivel de muescas no reparadas en el DNA, incremento en las rupturas y rearreglos de cromosomas y mayor sensibilidad a los mutágenos.

Cinc es requerido como cofactor para cobre/cinc superóxido dismutasa, endonucleasa IV, la función de p53, formamidopirimidina (FAPY)glicosilasa y en las proteínas dedo de cinc tales como las PARP. Su deficiencia incrementa la oxidación del DNA, los rompimientos de DNA y una tasa más alta de daño cromosómico.

Hierro es requerido como componente de ribonucleótido reductasa y los citocromos mitocondriales. Su deficiencia reduce la capacidad de reparación del DNA y un incremento en la propensión de daño oxidativo al DNA mitocondrial.

Magnesio es requerido como cofactor para varias DNA polimerasas, en la reparación de escisión de nucleótidos, reparación de escisión de bases y en la reparación de discordancias. Es esencial para la polimerización de microtúbulos y en el segregación de cromosomas. Su deficiencia reduce la fidelidad de la replicación del DNA, una reducción en la capacidad de reparación del DNA así como errores en la segregación de cromosomas.

Manganeso es requerido como un componente de manganeso superóxido dismutasa mitocondrial. Su deficiencia incrementa la susceptibilidad al daño por superóxido al DNA mitocondrial y una reducción en la resistencia al daño inducido por la radiación al DNA nuclear.

Calcio es requerido como cofactor para la regulación del proceso mitótico y la segregación de cromosomas. Su deficiencia provoca la disfunción mitótica y errores en la segregación de cromosomas.

Selenio es requerido como parte de las selenoproteínas involucradas en el metabolismo de metionina y el metabolismo antioxidante (selenometionina, glutatión peroxidasa I). Su deficiencia incrementa las rupturas en las cadenas de DNA, la oxidación del DNA y al acortamiento de los telómeros.

El perfil dietario difiere entre individuos en varios grados, dependiendo de sus preferencias dietarias adquiridas o heredadas así como de la disponibilidad de alimentos; adicionalmente, la captura de micronutrimentos desde el sistema digestivo y el transporte hacia las células del cuerpo también varía dependiendo de la genética y la expresión alterada de los transportadores que sucede con la edad. Los factores nutricionales son requeridos no solamente para el mantenimiento del genoma in vivo sino también in vitro, la cual varía en gran medida, dependiendo del medio de cultivo utilizado. El mantenimiento de la integridad del genoma in vitro es crítico, particularmente en cultivo celular a largo plazo (por ejemplo las células madre), las cuales pueden ser tomadas del cuerpo para su expansión y luego regresadas al donador original o a otros recipientes por terapia médica debido a que el daño acumulado al DNA in vitro puede resultar en eventos oncogénicos en las células madre.

Actualmente los valores de referencia dietarios (como las ingestas diarias recomendadas o los límites superiores de seguridad) y las recetas de medios y condiciones de cultivo no toman en consideración el impacto en la integridad del genoma a pesar de que el daño a la secuencia del DNA y/o al epigenoma es la patología más fundamental y crítica subyacente a la salud y la enfermedad tanto celular como del organismo.

Necesidades y vacíos del conocimiento

Un tema crítico en el cultivo tisular es la falta evidente de condiciones fisiológicas tanto en términos de composición del medio de cultivo como en la tensión de oxígeno, que tienen impactos profundos en la tasa de crecimiento de las células y en el nivel de inestabilidad cromosómica de éstas. Por ejemplo, las recetas de medio de cultivo pueden variar enormemente entre sí con respecto a minerales y vitaminas, y frecuentemente la concentración es suprafisiológica en comparación con el suero humano, o deficiente dependiendo del micronutrimento. El medio de cultivo RPMI 1640, desarrollado por el Roswell Park Memorial Institute (actualmente el Roswell Park Cancer Institute) en 1966 y uno de los más frecuentemente utilizados para el cultivo de células humanas, es suprafisiológico para folato, metionina y riboflavina y deficiente para hierro, cobre, cinc, calcio, magnesio y azufre en relación al suero humano.

Mientras algunas de las deficiencias en los medios de cultivo pueden ser atendidas por la adición de suero bovino fetal, este se agrega solamente al 5%-10%, lo que podría aún mantener al medio de cultivo como deficiente si el micronutrimento está ausente o deficiente en la receta. Es evidente que los medios de cultivo actuales no corresponden fisiológicamente al plasma humano y por lo tanto los datos obtenidos de los experimentos in vitro deben ser tratados con cautela si se hacen intentos para extrapolarlos a predicciones in vivo. Esto solamente puede ser factible una vez que los medios de cultivo fisiológico sean desarrollados de manera que sean equivalentes en composición al plasma humano y otros fluidos corporales (fluido cerebroespinal, fluido intersticial, etc.) y si la tensión de oxígeno (presión parcial de las moléculas de oxígeno disueltas) utilizada es similar a la experimentada por los tejidos en el cuerpo. La tensión de oxígeno fisiológica es al menos 2-4 veces más bajas que la del oxígeno atmosférico utilizado típicamente en las incubadoras para cultivo de células; se ha demostrado que las células que crecen bajo condiciones fisiológicas de oxígeno experimentan menor estrés oxidativo y paradójicamente crecen más lentamente que las células en incubadoras con oxígeno atmosférico. El crecimiento más rápido no resulta necesariamente en una mejor estabilidad del genoma debido a que podría deberse a permisividad de los puntos de control del ciclo celular, causando una reducción en el tiempo del ciclo celular y/o una apoptosis reducida de las células con daño del DNA.

Se ha mostrado que el daño al DNA, la muerte celular y el crecimiento celular en las células cultivadas son fuertemente afectados por la concentración de micronutrimentos esenciales, de manera que la deficiencia o el exceso dentro del rango fisiológico puede dañar profundamente el genoma y alterar el crecimiento celular y la cinética de supervivencia. El uso de concentraciones excesivamente altas de donadores de metilo (folato, metionina, colina, vitamina B12) en el medio de cultivo puede derivar, teóricamente, en un patrón adverso de metilación del DNA que puede inapropiadamente silenciar importantes genes de mantenimiento, aunque no hay evidencia fuerte en apoyo a esta hipótesis. Es evidente que, dado el amplio espectro de micronutrimentos requeridos para el mantenimiento y reparación del genoma, que el desarrollo de una composición fisiológica de medio de cultivo es un importante prerrequisito para permitir la determinación de condiciones óptimas de cultivo para el crecimiento de células humanas en un estado genómicamente estable y para explorar el impacto de varias combinaciones de micronutrimentos (nutriomas) y dosis contra diferentes fondos genéticos.

Estos desarrollos son también críticos si deseamos utilizar los datos in vitro de una manera confiable para predecir efectos nutricionales in vivo en una base individual. En este sentido es importarte notar que las concentraciones alcanzables de micronutrimentos in vitro podrían no ser posibles in vivo debido a la excreción y redistribución dentro de los tejidos. Adicionalmente, con respecto a los fluidos corporales, tenemos tan solo buen conocimiento sobre las posibles concentraciones de micronutrimentos en el plasma sanguíneo, mientras que nuestro conocimiento sobre los fluidos intersticiales que rodean los órganos o dentro de los tejidos está en una etapa rudimentaria. Necesitamos considerar las condiciones óptimas tanto dentro del rango fisiológicos como del suprafisiológico, pero solamente utilizar rangos de dosis fisiológicas alcanzables in vivo para las predicciones in vivo.

Con respecto a la optimización de la salud celular in vitro e in vivo, se reconoce cada vez más ampliamente que los parámetros del daño del genoma y el epigenoma son exquisitamente sensibles a cambios en la concentración de micronutrimentos, aún dentro del rango fisiológico “normal”. Es, por lo tanto, práctico, factible y deseable comenzar a reexaminar los valores de referencia dietaria de manera que las ingestas recomendadas coincidan con el alcanzar las concentraciones tisulares que son consistentes con el daño minimizado al DNA.

La prueba de nutriomas en los arreglos (matrices) de nutrimentos

El mayor desafío en la genómica nutricional es hacer el salto cuántico desde un enfoque reduccionista de interacción individual nutrimento-gen hacia el estudio de la interacción de la combinación completa de nutrimentos (el nutrioma) con el genoma completo en una base de individuo por individuo. La meta última es encontrar de manera efectiva en un individuo el nutrioma que mejor coincide con su genoma, de manera que la función celular y el mantenimiento del genoma y el epigenoma sean optimizados.

La “piedra Rosetta”, mecanismo o código, para revelar este rompecabezas descansa en el desarrollo de arreglos (matrices o arrays) de nutrimentos en sistemas de microcultivo de manera que múltiples nutriomas pueden ser probados simultáneamente, mientras se toma en consideración el impacto de la dosis en la valoración. Es posible que la microplaca que produce células que pueden proliferar adecuada y viablemente mientras se mantiene la estabilidad óptima de genoma y epigenoma represente el nutrioma más apropiado para esas células de individuo. El desarrollo de análisis automatizado, de alto contenido, del daño celular, se ha vuelto posible empleando citometría de imagen cuantitativa, de manera que múltiples mediciones pueden ser capturadas simultáneamente en células en interfase, incluyendo el número de células y su contenido de DNA nuclear, múltiples mediciones de la estabilidad genómica tales como la longitud de telómero y aneuploidía (número anormal de cromosomas) por hibridización por fluorescencia in situ (FISH, por sus siglas en inglés), guanina oxidada y metilación del DNA por inmunohistoquímica, daño a cromosoma y fusiones de cabezas de telómero por ensayos de micronúcleos del citoma en células binucleadas con bloqueo de la citocinesis (separación física del citoplasma en dos células hijas durante la división celular) -ensayo CBMN Cyt, por sus siglas en inglés-, etc.

Dicho sistema identificaría también el rango de deficiencia y límite superior seguro para ese individuo en múltiples micronutrimentos dentro de un solo barrido (escaneado) e identificar algunas combinaciones inesperadas que podrían ser citotóxicas o genotóxicas. La plausibilidad de dicha posibilidad es apoyada por la observación de que la inestabilidad del genoma se incrementa bajo condiciones de folato bajo (20 nM) si la concentración de riboflavina es incrementada a estatus repleto, posiblemente debido a que éste ultimo, que es el precursor del cofactor dinucleótido de flavina adenina (FAD, por sus siglas en inglés) para la enzima metilenotetrahidrofolato reductasa (MTHFR, por sus siglas en inglés) ,incrementa la actividad de MTHFR lo que cataliza la conversión irreversible de 5,10-metilenotetrahidrofolato a 5-metiltetrahidrofolato, haciendo la primera especie de folato menos biodisponible para la síntesis de dTMP a partir de dUMP e incrementando así el uracilo en el DNA. El uracilo excesivo en el DNA causa sitios abásicos y rupturas en la cadena del DNA cuando las uracilo glicosilasas tratan de reparar esta lesión altamente mutagénica. Por tanto es importante desarrollar un sistema de array de nutrimento que pueda estudiar eficientemente múltiples combinaciones de micronutrimentos en diferentes dosis.

Este tipo de enfoque tiene la ventaja adicional de que vuelve posible identificar un nutrioma del individuo para el mantenimiento de la salud del genoma sin necesidad de conocer el fondo genérico de la persona. Adicionalmente, dichos sistemas podrían también ser usados para comparar la respuesta de diferentes genotipos bajo las mismas condiciones de nutrioma y estimar el porcentaje de varianza de los biomarcadores medidos que son explicados por diferentes genotipos y diferentes nutrimentos en los nutriomas probados, incluyendo sus interacciones.

Se han diseñado prototipos de este enfoque por varios grupos de investigación, para estudiar los efectos interactivos del daño al DNA, la muerte celular y el crecimiento celular. Entre ellos están. a) diferentes relaciones de azufremetionina y selenometionina a una concentración fisiológica constante de metionina; b) concentración de folato con alcohol; c) concentración alcohol/acetaldehido y el genotipo alcohol deshidrogenasa 1 (ADH1) o el genotipo aldehído deshidrogenasa 2 (ALDH2); d) concentración de folato con el genotipo cáncer de mama 1 (BRCA1) o el genotipo cáncer de mama 2 (BRCA2); e) concentración de folato con concentración de riboflavina con el genotipo MTHFR C677T.

En estos estudios, el ensayo CBMN Cyt fue utilizado para obtener múltiples mediciones de la inestabilidad cromosómica, la muerte celular y la división celular. Los resultados de este enfoque son muy prometedores debido no solo a que pueden definir el porcentaje de variación en los biomarcadores de genotoxicidad, citotoxicidad, metabolitos y crecimiento celular que es atribuible a un micronutrimento específico, al genotipo y a las interacciones entre estos parámetros, sino que también define la forma de la curva dosis-respuesta del nutrimento/daño al DNA para tipos celulares genéticamente definidos. El uso del ensayo CBMN Cyt es particularmente relevante para este propósito porque la incidencia relativa del daño al DNA, los eventos de muerte celular y la citóstasis (bloqueo del proceso de mitosis) varían a medida que los micronutrimentos y sus concentraciones dentro del nutrioma son incrementados o decrementados en múltiples combinaciones.

Los nutriomas relevantes dentro de una sola ruta metabólica pueden involucrar más de un par de micronutrimentos; por ejemplo, el ciclo folato-metionina requiere folato en varias formas como un sustrato, así como betaína, vitamina B12, vitamina B6 y vitamina B2 como cofactores. Por lo tanto, el array del nutrimento debe también ser diseñado para estudiar combinaciones de múltiples micronutrimentos simultáneamente en una manera asociada a la dosis y en diferentes o contrastantes niveles de dosis para cada micronutrimento en relación a los demás.

El sistema de array de nutrimento in vitro sería también un mecanismo ideal para probar si las predicciones de modelos matemáticos nutrigenómicos emergentes en rutas metabólicas clave específicas son ciertos, debido a que es probable que este sistema sea menos afectado que los modelos humanos in vivo por problemas asociados al cumplimiento de la intervención dietaria y a variables inesperadas de estilo de vida y exposición tales como el estrés y el consumo de drogas recreativas, así como los genotóxicos ambientales que pueden impactar los índices medidos de daño al genoma. Además, es financieramente prohibitivo realizar pruebas de múltiples combinaciones de micronutrimentos in vivo.

Hacia el futuro

La realización de la promesa de sistemas de arrays de nutrimentos es dependiente de los siguientes desarrollos tecnológicos:

1. Sistemas de cultivo fisiológico basados en la composición apropiada del medio de cultivo para reflejar exactamente la composición real del fluido extracelular en diversos ambientes tisulares (plasma, fluido cerebroespinal, etc.) así como la correcta tensión de oxígeno que puede modificar la susceptibilidad y tasas de división nuclear y celular.

2. El tema de los requerimientos de nutrimentos basados en la cinética de la división celular podría ser significativo, pero permanece inexplorado. Los sistemas de arrays de nutrimentos necesitarán ser desarrollados tanto para cultivos celulares divisorios y no divisorios (confluentes), incluyendo cultivos en 3 dimensiones, con poblaciones mixtas de células en división y no división para probar si los requerimientos nutrimentales para el mantenimiento del genoma podrían variar dependiente del estatus de división celular.

3. Debido al enorme número de posibles combinaciones de micronutrimentos (vitaminas, minerales, fitonutrimentos, antioxidantes y aminoácidos, entre otros) se requiere un sistema de alto rendimiento que sea capaz de medir biomarcadores del crecimiento celular, la muerte celular y el daño al DNA en microcultivos de células utilizando análisis de alto contenido con sistemas de imagen celular que idealmente realizarán dichas mediciones de manera simultánea en una forma que no sea destructiva de las células para que puedan realizarse mediciones en varios días con requerimientos mínimos de números de células. La habilidad para realizar mediciones continuas por varios días o semanas es particularmente relevante para la nutrición debido a que los efectos de los micronutrimentos son crónicos más que agudos y su impacto podría ir a la deriva a medida que las células se adaptan a los diferentes ambientes del nutrioma al que son expuestas en el sistema de array de nutrimentos.

4. Idealmente, dichos sistemas serán capaces de estudiar no solamente los requerimientos nutrimentales óptimos para el crecimiento y el mantenimiento del genoma de las células normales de un individuo, sino también verificar que dicho nutrioma no estimule el crecimiento de células cancerosas que el individuo pudiera tener. Es factible que las células cancerosas tengan un genotipo marcadamente diferente al de las células normales del anfitrión y pudieran responder de manera diferente al mismo ambiente del nutrioma. Por ejemplo, algunas células cancerosas amplifican el receptor de ácido fólico de alta afinidad, dándoles una ventaja distintiva sobre las células normales cuando el folato es un factor limitante, al acceder al folato del fluido circundante. El nutrioma ideal para un individuo que envejece o con tendencia al cáncer sería la combinación que no solamente sostiene la reposición de células normales en una manera genéticamente integral sino que también inhibe el crecimiento de células cancerosas. Es concebible que tanto las células normales como las células cancerosas de un individuo puedan ser probadas simultáneamente dentro de un mismo sistema de array de nutrimentos.

5. Como fin último, aunque dichos sistemas pueden ser rápidamente implementados para la optimización de las condiciones de cultivo in vitro de células, su uso práctico será mejorado en gran medida una vez que hayan sido validados para la predicción de los requerimientos nutrimentales in vivo para un individuo. Los datos de un nutrioma in vitro óptimo, después de la comparación con la concentración en plasma, pueden ser utilizados para estimar las deficiencias o excesos de los micronutrimentos en los fluidos corporales y diseñar las intervenciones dietarias apropiadas para hacer los ajustes necesarios para optimizar la estabilidad del genoma. Este enfoque podría ser utilizado en la modalidad emergente de medicina integradora y preventiva, basada en las ‘Clínicas de Salud del Genoma’ (GHC, por sus siglas en inglés), en las cuales las enfermedades del desarrollo y degenerativas son prevenidas vía el diagnóstico y prevención nutricional del daño al DNA. Todavía debe confirmarse si dichos intentos por optimizar el estatus de micronutrimentos deberá estar limitado a aquellos con niveles de daño al DNA por arriba del promedio, hasta que podamos encontrar cual el el nivel mínimo de daño al DNA alcanzable in vitro o in vivo.

6. El que el sistema de array de nutrimentos pueda ser adaptado para su uso directo con una muestra de los propios fluidos corporales de un individuo es una pregunta importante, pues esta puede ser una mejor base para la prueba in vitro de la eficacia de múltiples ajustes nutrimentales bajo condiciones que reflejen exactamente el estatus fisiológico actual del individuo. Aunque este enfoque parece atractivo, su factibilidad debe ser explorada y podría estar limitada por la dificultad de cultivar células en suero humano.

7. Siempre habrá la necesidad de revisar los biomarcadores de daño al DNA que son más apropiados para su uso en el sistema de array de nutrimentos, basándose en sus estatus de validación. En este momento, el ensayo CBMN Cyt es el mejor validado con relación a su sensibilidad al estado nutricio y asociación prospectiva con la mortalidad por cáncer y enfermedad cardiovascular. Finalmente, se requeriría un enfoque de análisis automatizado de alto contenido que integre múltiples biomarcadores complementarios del daño e inestabilidad del genoma (mutaciones del DNA mitocondrial, longitud de los telómeros, metilación del DNA, micronúcleos, puentes nucleoplásmicos) para alcanzar una profunda comprensión de los requerimientos nutrimentales óptimos para el mantenimiento del genoma en una base individual.

8. Los linfocitos de sangre periférica son ideales para utilizarse en un sistema de array de nutrimentos debido a que son fáciles de obtener y cultivar, y han sido utilizados extensamente para medir el daño al DNA in vitro e in vivo. Adicionalmente, dado que viajan a través del cuerpo, experimentan fluctuaciones en las concentraciones de micronutrimentos y perfiles del nutrioma que pueden ocurrir en diferentes tejidos y por lo tanto pueden integrar los impactos genómicos de la nutrición subóptima a través del cuerpo humano. Todavía deberá definirse si los efectos en los linfocitos podrían reflejar lo que pasaría en otros tejidos, tales como los epiteliales, ya que es difícil cultivar fácilmente los tejidos epiteliales accesibles como la mucosa bucal. Dos estudios recientes sugieren que el nivel de micronúcleos en los linfocitos se correlacionan bien con los micronúcleos en las células bucales y con el daño al DNA en el esperma. Sin embargo, a pesar de estos resultados prometedores, se requiere mucha más evidencia para justificar el uso exclusivo de linfocitos en el sistema de array de nutrimentos e idealmente el desarrollo de una alternativa de cultivo práctico de células epiteliales.

En conclusión, el uso de sistemas de arrays de nutrimentos para estudiar las respuestas genómicas a múltiples dosis y combinaciones de nutrimentos es en principio factible y constituye una gran promesa para definir los requerimientos del nutrioma de cualquier tipo celular para sostener su crecimiento y reproducción en una manera genéticamente estable en el caso de células normales o células madre o para suprimir su crecimiento y causar su muerte en el caso de células cancerosas. El futuro de la nutrigenómica es prometedor.