Perspectivas para la metabolómica en la nutriología humana

Los científicos en nutriología y en medicina perfilan de manera rutinaria los biofluidos humanos para un rango de marcadores fisiológicos, incluyendo macronutrimentos y micronutrimentos así como un número limitado de metabolitos  conocidos por su asociación con la nutrición. Estos marcadores proporcionan información sobre el estado nutricio y los factores de riesgo para la salud y la enfermedad, tales como la biodisponibilidad de nutrimentos de las fuentes dietarias o las interrelaciones de metabolitos seleccionados y su correlación con la enfermedad, o deficiencias que los individuos pueden tener de nutrimentos esenciales, etc.

Es importante considerar que este enfoque de perfilado dirigido, usualmente prueba solamente una hipótesis nutricional específica, mide un marcador específico o investiga una ruta bioquímica específica, por lo cual los resultados son correlacionados o comparados con resultados predichos o valores de consumo recomendados. Hoy en día, sin embargo, han emergido las tecnologías analíticas que permiten la medición de miles de metabolitos y nutrimentos simultáneamente en una sola muestra. Esto abre numerosas posibilidades para estudiar los efectos e interacciones nutricionales de los metabolitos, con importantes aplicaciones tales como la determinación de biomarcadores de enfermedad y pre-enfermedad o la identificación del metabolismo individual de las personas, permitiendo a la nutrición personalizada atender problemas específicos de salud. Este enfoque integrador de medir la distribución y concentración de un amplio rango de metabolitos en una sola muestra (conocido como el metaboloma), resultando de la expresión de genes y proteínas, y correlacionando la información con un estado fisiológico o patológico conocido, se llama metabolómica.

La metabolómica nutricional se enfoca en estos metabolitos activos, nutrimentos (o no nutrimentos) entre los miles de componentes en el metaboloma que están asociados con los efectos que las diferentes dietas tienen en el cuerpo humano.

Biología de sistemas

Desafortunadamente, los metabolitos y los genes por si mismos no son suficientes para describir completamente los efectos de la nutrición. Los genes son transcritos en ácido ribonucleico (RNA, por sus siglas en inglés) y el RNA es traducido en proteínas, por lo que el cuadro completo de la nutrición debe incluir todas estas etapas. Diferentes proyectos multi-centro a gran escala están tratando de contestar las preguntas de la investigación nutricional a través de acercamientos de biología de sistemas, combinando la transcriptómica, la proteómica y la metabolómica, a fin de comprender cómo las dietas interactúan dentro del cuerpo humano. Estos experimentos altamente complejos y difíciles de diseñar requieren presupuestos significativos para cubrir la complejidad requerida. Adicionalmente, las herramientas bioinformáticas para conectar e integrar los diferentes juegos de datos están todavía en desarrollo, y  el manejo de los enormes volúmenes de datos toma con frecuencia varios años para completarse.

En otros campos de la ciencia, los datos están públicamente disponibles, tales como los datos de expresión génica a través del Gene Expression Omnibus del Centro Nacional de Información Biotecnológica de los Estados Unidos (NCBI, por sus siglas en inglés), permitiendo a la comunidad en bioinformática en todo el mundo desarrollar y probar nuevos algoritmos para la conversión de datos.

Actualmente, los estudios de biología de sistemas dedicados a la complejidad de la investigación nutricional son muy difíciles de realizar debido a los enormes presupuestos requeridos. Los avances tecnológicos en todas las áreas ómicas, sin embargo, permitirán indudablemente que dichos estudios avancen a mayor tasa en el futuro cercano.

Oportunidades para la nutrición humana

La metabolómica ofrece un acercamiento drásticamente diferente a la nutriología, como ya se ha visto en otras áreas de la investigación biomédica, como la farmacología y la toxicología. La investigación en nutrición será significativamente impactada por la metabolómica por varias razones. En primer lugar, el metabolismo y la nutrición están estrechamente ligados, y por tanto la metabolómica es la primera opción lógica para su aplicación dentro de las varias tecnologías ómicas (genómica, transcriptómica, proteómica y metabolómica, entre otras). Otra importante ventaja es que la metabolómica, y las técnicas metabolómicas, estudian y consideran la complejidad metabólica completa de las dietas. La clásica investigación en nutrición, reduccionista y regida por hipótesis, prueba un compuesto a la vez, lo que ha derivado en hallazgos clave tales como la importancia de las vitaminas y minerales. Sin embargo, esta estrategia sufre con los componentes de los alimentos o las dietas, los cuales tienen funciones biológicas más sutiles y menos explícitas. En el enfoque clásico, la complejidad de los patrones dietarios es reducida a uno o varios metabolitos, que se cree representan un grupo mayor. Por ejemplo, en estudios sobre aceite de pescado, el ácido eicosapentaenoico es con frecuencia utilizado para describir el grupo entero de poliinsaturados, o en el caso de la dieta mediterránea los flavonoides son representados por un solo compuesto, la quercetina. En estos casos, los efectos positivos para la salud o para el tratamiento de una enfermedad se vuelven extremadamente difíciles de probar en estudios de intervención. Un enfoque metabolómica es mucho más poderoso porque tiene el potencial de revelar cuales componentes de la dieta son responsables por cual efecto.  Finalmente, la metabolómica tendrá un tremendo impacto en la investigación nutriológica a través del descubrimiento de nuevos e importantes biomarcadores. De hecho, la investigación sobre biomarcadores será la fuerza regidora en el rápido progreso de la investigación en nutrición en el futuro, porque la nutrición trata con enfermedades y con la salud de los humanos. Mientras que la patología de la enfermedad y los resultados clínicos pueden usualmente ser claramente definidos, la salud es mucho más difícil de describir y las mejoras en la salud pueden raramente ser medidas. Los biomarcadores apropiados nos permitirán determinar con precisión la salud y los cambios en la salud, en el futuro. Los biomarcadores pueden también revelar la ingestión dietaria. El desarrollo de metodologías para determinar exactamente lo que las personas están comiendo ha sido siempre esencial en la investigación nutriológica; los biomarcadores de ingestión nutricional serán extremadamente importantes para esta área, pero se espera que requieran una cantidad significativa de investigación metabolómica bien enfocada.

Tecnologías y estrategias analíticas para la metabolómica

La metabolómica ha emergido como una tecnología complementaria a las otras disciplinas ómicas, en particular la genómica, la transcriptómica y la proteómica, a las cuales conciernen las mediciones de DNA, mRNA, proteínas y sus interacciones. A diferencia de estas disciplinas, las cuales aplican una técnica analítica o medición individual, al menos en teoría, a una sola clase química de compuestos, la metabolómica perfila poblaciones enteras de metabolitos químicamente muy diversos de bajo peso molecular. Más aún, los niveles de concentración relativa de estos compuestos están en el rango desde ultra traza (picomolar o menos) a milimolar o aún niveles más altos, excediendo con frecuencia los rangos lineales dinámicos de las técnicas analíticas aplicadas.

Debido a estos retos analíticos, el campo de la metabolómica está actualmente siendo regido por desarrollos tecnológicos. Las 2 técnicas más comúnmente utilizadas son la espectroscopia por resonancia magnética nuclear (NMR, por sus siglas en inglés) y la espectrometría de masas (MS, por sus siglas en inglés). La MS está casi siempre combinada con una etapa preliminar de separación cromatográfica, ya sea cromatografía de gases (GC-MS, por sus siglas en inglés) o cromatografía líquida (LC-MS, por sus siglas en inglés) -o espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS).

Es importante considerar que algunas de las nuevas tecnologías analíticas son tan sensibles que es muy posible que puedan identificar compuestos previamente indetectados, obteniendo resultados que posiblemente estén en conflicto con los resultados de estudios previos. Adicionalmente, en muchos casos, las estructuras de los metabolitos candidato serán desconocidas en la etapa de descubrimiento del estudio metabolómico, requiriendo por lo tanto de un extenso trabajo de elucidación de la estructura en la subsecuente etapa de validación.

En la mayoría de los estudios en metabolómica, juegos diferenciales de muestras son analizados comparando directamente dos situaciones y buscando diferencias significativas entre ellas; por ejemplo, obeso vs delgado, diabético vs no diabético, etc. La metabolómica puede tener sesgo o no sesgo (dirigida o no dirigida) dependiendo de si una ruta hipotética es investigada con un grupo objetivo (target) de metabolitos conocidos o si la ruta es totalmente desconocida y el análisis debe cubrir el complemento completo del metaboloma en cuestión.

Igualmente importante que las tecnologías analíticas son los métodos utilizados para encontrar las correlaciones significativas entre los metabolomas bajo investigación. Herramientas de punta en bioinformática, prospección (minado) de datos y bases de datos, están emergiendo rápidamente para manejar e interpretar los masivos juegos de datos que surgen de estos experimentos.

Prospección de datos

La investigación en metabolómica es relativamente rápida y poco costosa, comparada con otras disciplinas ómicas, por ejemplo, transcriptómica y proteómica. Es importante considerar que facilita la inclusión de experimentos en varios puntos de tiempo y el uso de un gran número de variables y replicados, mientras que para los experimentos con micromatrices (microarrays) y tecnología de identificación multidimensional de proteínas en proteómica, las muestras son usualmente reunidas (pooled) para reducir tiempo y costos. Empleando mayor cantidad de muestras y variables, sin embargo resulta en vastas cantidades de datos.

Uno de los principales retos en la metabolómica, por tanto, es la conversión de estos complejos ratos crudos en información útil. La primera etapa es la reducción de datos. La mayoría de los experimentos en metabolómica se enfocan en la conversión de archivos de datos crudos de LC-MS a listas de picos, en donde cada pico tiene uno o más identificadores (tiempo de retención y m/z o espectro MS2 de espectrometría de masas en tándem) y una intensidad o nivel, los cuales deben relacionarse a la cantidad de compuesto responsable por dicho pico. Mientras que los datos de LC-MS son continuos y multidimensionales, las listas de picos son usualmente bidimensionales y pueden ser fácilmente convertidos en hojas de datos. El análisis de componentes principales (PCA, por sus siglas en inglés) y estrategias relacionadas serán normalmente aplicadas primero para la interrogación de datos. PCA es una técnica no supervisada que determina las diferencias de correlación entre juegos de datos, que pueden ser causadas por diferencias biológicas o por un sesgo metodológico. En la mayoría de los casos, es una forma altamente informativa de obtener una primera impresión de la calidad de los datos adquiridos, independientemente de la cuestión actual de la investigación. Por ejemplo, PCA puede diferenciar entre el perfil metabólico de hombres y mujeres así como vegetarianos y no vegetarianos. Cuando los datos revelan efectos dependientes de la corrida analítica, esto es usualmente el resultado de un método inadecuado de normalización de datos. Los procesos óptimos de normalización son extremadamente difíciles de lograr sin muestras de control apropiadas, las cuales son, por tanto, una parte esencial de cualquier experimento en metabolómica.

En una etapa de seguimiento, puede ser utilizada estadística multivariada (que estudia 3 o más variables) supervisada, por la cual el método más comúnmente aplicado es el análisis discriminante por mínimos cuadrados parciales (PLS-DA, por sus siglas en inglés). Las técnicas supervisadas utilizan el conocimiento previo sobre las muestras (por ejemplo, cuales muestras se sabe que pertenecen a cierto grupo). No obstante, para números de variables mucho más grandes que el número de muestras, existe una severa posibilidad de sobreajuste de los datos. Además del concepto de diferenciación de picos, también es posible utilizar herramientas de prospección de datos para buscar picos correlacionados (correlacionando en una forma lineal o no lineal). Esto resulta en redes de correlación que proporcionan información adicional sobre la interconectividad de los picos y los metabolitos.

En general, la meta de esta etapa es reducir la lista completa de picos a una lista mucho más corta de picos ‘interesantes’. La relevancia de estos picos interesantes debe ser valorada, que en la mayoría de los casos es conducida inicialmente basándose en la información química. La forma del pico y el comportamiento a través de la muestra serán cuestionados para checar si un metabolito real está presente o si un artefacto del método causó el pico. Adicionalmente, la información química será utilizada para clasificar o identificar el metabolito responsable.

Bases de datos

Una de las principales fuerzas impulsoras en los rápidos desarrollos técnicos que tienen lugar en la era post-genómica es las bases de datos de acceso abierto. Hoy en día puede obtenerse abundancia de información de manera fácil alineando secuencias de proteína o DNA con estas bases de datos basadas en internet. Aunque existe todavía una oportunidad razonable de que las secuencias sean regresadas como marcos de lectura abiertos (open reading frames) desconocidos, en muchos casos la búsqueda mostrará que la proteína o gen es un gen conocido o similar a un gen conocido, con una función conocida, facilitando la interpretación biológica. Los metabolitos, sin embargo, son intrínsecamente diferentes. En donde las proteínas y genes con la misma función son similares en estructura a través de los organismos, los metabolitos poseen la misma estructura, pero funciones similares o diferentes a través de los organismos.

Esta no es la única desventaja encontrada en metabolómica, porque la similitud estructural es mucho más difícil de valorar con moléculas pequeñas, pues no pueden ser reducidas a una secuencia de bloques constructores, en la forma en que DNA es una cadena de nucleótidos y las proteínas son una cadena de aminoácidos. Aun la asignación no ambigua de un pico cromatográfico a un metabolito es un proceso laborioso. Esta es una de las principales razones por la cual muchos grupos en metabolómica dependen fuertemente del análisis por NMR para el perfilado metabólico, dado que rinde espectros que son razonablemente similares a través de diferentes institutos y diferentes fabricantes de instrumentos. Por otro lado, LC-MS/MS no proporcionan generalmente estos resultados universales y estandarizados. Los tiempos de retención cromatográfica son difíciles de reproducir y los espectros de masa del mismo metabolito son con frecuencia específicos para el proveedor del espectrómetro de masas. Hay, no obstante, varias bases de datos de acceso abierto que contienen información espectral de masa, por ejemplo, la base de datos del metaboloma humano, Massbank y Metlin. La creciente velocidad y resolución de los espectrómetros de masa reducirá aún más el número de posibles candidatos para cada pico cromatográfico, y cuando estos resultados sean combinados con otra información espectral (en particular datos MSn de alta resolución), es de esperarse que los espectrómetros de masa futuros serán capaces de proporcionar suficiente información con suficiente precisión para la búsqueda rápida en la base de datos y la clasificación de los metabolitos, superando las diferencias actuales en el tipo y marca de máquina. Aun cuando la búsqueda automatizada en bases de datos no está universalmente disponible todavía para las aplicaciones en metabolómica, los diferentes grupos de investigación han comenzado a establecer bases de datos a gran escala sobre metabolitos, por ejemplo, la Kyoto Encyclopaedia on Genes and Genomes, la cual integra metabolitos con proteínas y genes. Esta información es relevante en los experimentos metabolómicos, y la habilidad para buscar rápidamente por la función de un gen específico ayuda a comprender la relevancia de un metabolito particular en el experimento.

La metabolómica nutricional, sin embargo, es aún más compleja. Los humanos son organismos heterotróficos; esto es, se alimentan de otros organismos, cada uno con su propio metaboloma. El número de diferentes metabolomas que consumimos diariamente en nuestra dieta es significativo, haciendo la metabolómica nutricional drásticamente más compleja que otras disciplinas metabolómicas. Consideremos un ejemplo sencillo: la cantidad de calorías o el contenido de proteínas, grasas y carbohidratos de un tazón de cereal puede encontrarse fácilmente en la literatura; el perfil metabólico del mismo tazón de cereal, no obstante, es extremadamente complejo y probablemente consistirá de varios miles (si no es que decenas de miles) de diferentes metabolitos, la mayoría de los cuales son desconocidos o no están disponibles en alguna base de datos de acceso abierto.

Validación

La siguiente etapa en el experimento metabolómico, luego de que los datos gruesos son reducidos a una lista costa de metabolitos significativamente diferenciados, los cuales están plenamente identificados o al menos son metabolitos clasificados, es la interpretación y correlación con el fenotipo. En la mayoría de los casos, sin embargo, en donde se emplean métodos sin sesgo o no dirigidos, es altamente deseable validar más los resultados. Es muy difícil validar un método de perfilado metabólico, pues las diferencias encontradas entre los juegos de muestras pueden ser simplemente el resultado de artefactos de la metodología más que resultados genuinos. Es por lo tanto esencial confirmar los resultados con un método analítico dirigido. En esta etapa, se asume que los diferentes picos se originan de metabolitos conocidos o clasificados, lo cual puede ser fácilmente confirmado reanalizando las muestras específicamente para estos compuestos, utilizando estándares auténticos y(o métodos previamente publicados y validados. Esta etapa esencial en la metabolómica es omitida con mucha frecuencia, pero es claramente requerida para evitar la especulación.

Genética, genómica y metabolómica

La farmacogenómica y la nutrigenómica están eliminando el concepto idealizado de que todos los humanos reaccionan de la misma manera en un experimento. La metabolómica muestra que los fenotipos metabólicos pueden ser específicos a cada persona. Las diferencias en genes derivan en diferencias en el metabolismo y diferencias en la eficacia de los compuestos. Estas diferencias pueden tener dramáticos efectos en farmacología, pero lo mismo aplica a la nutrición.

Colaboraciones internacionales, como el mapa del haplotipo del genoma humano, están mapeando los polimorfismos de un nucleótido (SNPs, por sus siglas en inglés) en el genoma humano, y estudios en el efecto de los SNPs en el metabolismo humano están avanzando rápidamente. Al mismo tiempo, los desarrollos tecnológicos hacen posible mapear de forma rápida y poco costosa todos los SNPs de una persona, y se espera que dentro de pocos años, este mapeado  de SNPs sea una etapa esencial en cada estudio nutricional que involucre a humanos. Aunque la información está ya disponible para predecir el efecto de un SNP, la habilidad de predecir los efectos de SNPs que interactúan está todavía a años de distancia, especialmente en relación al metabolismo. La metabolómica jugará un papel crucial en la comprensión de esta interacción y ayudará a elucidar cómo los SNPs específicos en interacción influyen la respuesta de una persona a una dieta.

El desarrollo de marcadores y chips genéticos ha también acelerado la investigación en genética humana. Grandes estudios que involucran a 10 mil o más sujetos permiten a los científicos determinar cuáles regiones del genoma son responsables de una enfermedad o la predisposición a la enfermedad. La interpretación de estos resultados es con frecuencia obscurecida por lo que llamamos efectos epistáticos, los cuales describen las interacciones específicas de regiones en el genoma que dificultan la habilidad para ligar un rasgo específico a una región específica. Los genetistas, no obstante, son dependientes de los detalles fenotípicos (rasgos) para ser capaces de mapearlos al genoma. Actualmente, esto es realizado principalmente con rasgos que son clínicamente relevantes y medibles tales como el peso, el índice de masa corporal o los niveles de glucosa en orina. Combinando datos nutricionales y metabolómicos a los fenotipos humanos, permitirá a los genetistas revelar cómo puede utilizarse esta información para cambios en la salud. Dichos proyectos demandan una acción concertada de diferentes disciplinas de investigación y son fuertemente dependientes de un número suficientemente grande de sujetos y suficiente detalle experimental para hacer progresos significativos en el futuro.

La investigación nutriológica y la nutrición en general se beneficiarían tremendamente de dichos proyectos, al abrir la posibilidad de la nutrición personalizada, de acuerdo a la genética específica de una persona. En el mismo contexto, vale la pena mencionar que la industria alimentaria reconocerá pronto que los perfiles genéticos específicos abrirán nuevos mercados.

Hacia el futuro

La metabolómica está cambiando rápidamente a la ciencia nutriológica, de la misma manera que cambió a otras áreas de la investigación biomédica en el pasado. Actualmente, el campo de la metabolómica nutricional está regido por químicos bioanalíticos conocedores de las tecnologías modernas, interesados en el desarrollo de métodos y tecnologías, por bioinformáticos que desarrollan nuevas herramientas de prospección de datos y bases de datos, y por bioquímicos de la nutrición que desean saber más sobre la influencia de los diferentes tipos de dietas a nivel molecular. Este seguirá siendo, probablemente, el caso por algunos años más hasta que la tecnología de la metabolómica sea suficientemente madura, amigable y poderosa.

La nutriología presenta demandas únicas a los científicos que están desarrollando técnicas de identificación metabólica para los metabolomas, lo que hace la metabolómica nutricional uno de los campos más emocionantes de la investigación bioanalítica en la actualidad. Los perfiles metabolómicos nutricionales dependen del tiempo pues el metabolismo es un proceso dinámico, requiriendo así múltiples puntos de tiempo en las intervenciones dietarias para medir el flujo metabólico. Adicionalmente, los metabolomas humanos no pueden ser aislados de los metabolomas ajenos que ‘interfieren’, tales como los de la microflora intestinal y aquellos de los organismos que consumimos en nuestra dieta. Estos factores complicadores requieren el desarrollo de metodologías analíticas de última generación, alto rendimiento y alta resolución, así como igualmente sofisticadas herramientas bioinformáticas para manejar y estudiar la cantidad masiva de datos analíticos crudos resultante.

El primer campo prometedor de aplicación en la metabolómica nutricional es el descubrimiento y aplicación de biomarcadores, como huellas de los metabolitos en el metaboloma que puedan ser correlacionados con cambios en la fisiología o con la detección temprana de un estado patológico. Es importante considerar que los estudios metabolómicos futuros develarán indudablemente biomarcadores de pre-enfermedad, basados en la detección de cambios muy sutiles en el metabolismo de individuos sanos, los cuales son signos tempranos de la enfermedad. Más aún, la metabolómica puede eventualmente revelar un verdadero biomarcador para un organismo sano más que los biomarcadores actuales para las enfermedades. El tratamiento nutricional puede entonces ser usado para mantener un metabolismo óptimo específico para cada individuo (nutrición personalizada). Se espera que la biología de sistemas, la nutrigenómica y la metabolómica abran la puerta para la nutrición personalizada, en donde las variaciones genéticas de los individuos y su influencia en el metabolismo nos permitirán utilizar dietas específicas para cada persona, a fin de mantener la salud y prevenir la enfermedad.