Características de los alérgenos más importantes en el cacahuate

El cacahuate (Arachis hypogea), conocido también como cacahuete o maní, pertenece a la familia Papilionacea del orden Fabales, que incluye al chícharo, el frijol, la soya, lupino, garbanzo y lenteja. En los países desarrollados, la alergia al cacahuate afecta al 0.4%-0.6% de los niños y el 0.3%-0.7% de los adultos. Ha habido un incremento en la incidencia observada de alergias al cacahuate en niños en años recientes, lo que se cree es el resultado de la creciente popularidad y uso de productos de cacahuate por la población así como la introducción de productos de cacahuate en las dietas infantiles en una etapa temprana. La exposición al alérgeno del cacahuate no es fácil de controlar en la población pediátrica, pues los cacahuates son generalmente consumidos como bocadillos (luego de ser tostados) y son componentes frecuentes de barras, chocolates y cereales de desarrollo, además de encontrarse en la cocina oriental.

Los estudios indican que cerca de 1.5 millones de estadounidenses sufren de alergia al cacahuate y cada año unos 30 mil pacientes son hospitalizados debido a síntomas de choque anafiláctico, de los cuales entre 150 y 200 casos han resultado fatales. La reacción alérgica al cacahuate puede ser inmediata (choque anafiláctico o puede ocurrir varias horas después de ser consumido. En la mayoría de los casos, las reacciones alérgicas son observadas después de consumir cacahuate, aunque en algunos casos la reacción puede ser disparada por saliva (besos, utensilios) o por inhalación del alérgeno. Se ha probado que el principal alérgeno del cacahuate, Ara h 1, es relativamente fácil de limpiar de manos y cubiertas con agentes de limpieza comunes y no parece estar ampliamente distribuido en escuelas.

La alergia al cacahuate es causada por proteínas en la semilla. Como todas las semillas, el cacahuate es rico en proteína, en particular las llamadas proteínas de almacenamiento que sirve como material de reserva durante el crecimiento de una nueva planta. Se ha demostrado que algunas de estas proteínas de almacenamiento son los alérgenos más importantes: vicilinas y albúminas.

Hasta ahora se han identificado 10 alérgenos en el cacahuate. El principal alérgeno es Ara h 1, el cual es una vicilina; el otro alérgeno importante es Ara h 2 (2S albúmina). Estos dos alérgenos son la causa del 95% de las reacciones alérgicas al cacahuate. Los alérgenos menores en el cacahuate son araquina (legumina) –Ara h 3 y Ara h 4-, profilina –Ara h 5-, 2S albúminas –Ara h6 y Ara h 7-, oleosina, aglutinina y Ara h 8 (la familia Bet v 1). La sensibilización al cacahuate ocurre generalmente durante la infancia y con frecuencia persiste a lo largo de la vida; en este sentido, la alergia al cacahuate difiere de otras alergias alimentarias frecuentes (como la alergia a las proteínas del huevo o de la leche), las cuales prevalecen en la infancia pero usualmente se desvanecen en la vida adulta.

Ara h 1

El principal alérgeno del cacahuate, Ara h 1, también conocido como conaraquina, pertenece a las globulinas de almacenamiento en la semilla. Es una glicoproteína de 65 kDa, alta en manosa y N-glucanos complejos, con punto isoeléctrico acídico. Ara h 1 fue identificado como un alérgeno importante del cacahuate en 1991 y producido como Ara h1 recombinante en 1995. Ara h 1 es una proteína homotrimérica perteneciente a la superfamilia cupina, la cual contiene proteínas estructuralmente relacionadas (vicilinas): faseolina del frijol común, canavalina del frijol Jack, germina de la cebada y proglicinina de la soya.  Los monómeros Ara h1 de la vicilina consisten de un motivo cupina formado por 2 módulos arreglados en tándem, relacionados por un eje seudosimétrico (pseudodyad-axis); cada módulo consiste de un dominio núcleo barril beta, construido a partir de 2 paredes de láminas βα antiparalelas, asociadas a un dominio en rizo que contiene predominantemente α-hélices.  Una región ligadora conteniendo α-hélices interconecta los dos módulos. Los tres motivos cupina de la vicilina están putativamente arreglados en una estructura homotrimérica alrededor de un eje de simetría triple. Las interacciones hidrofóbicas son la principal fuerza molecular que mantiene a los monómeros juntos. Los aminoácidos hidrofóbicos que contribuyen a la formación del trímero están en los extremos distales de la estructura tridimensional en donde ocurren los contactos monómero-monómero. La mayoría de los epítopes que se ligan a la inmunoglobulina E (IgE) están también localizados en esta región, sugiriendo que pueden ser protegidos de la digestión por los contactos monómero-monómero. Al incubar Ara h 1 con enzimas digestivas, se identificaron varios fragmentos resistentes a proteasa conteniendo sitios ligadores a IgE. A naturaleza altamente estable y la localización estratégica de los epítopes ligadores a IgE indican que la estructura cuaternaria de la proteína puede jugar un papel significativo en la alergenicidad general.

Empleando IgE sérica de una población de individuos hipersensibles al cacahuate, se han mapeado 23 epítopes ligadores a IgE de Ara h 1. Los epítopes inmunodominantes encontrados son: Ara h 1 25–34 (KSSPYQKK), Ara h 1 65–74 (EYDPRLVY), Ara h 1 89–98 (ERTRGRQP) y Ara h 1 498–507 (RRYTARLKEG). Los otros epítopes IgE identificados fueron: Ara h 1 48–57 (QEPDDLKQKA), Ara h 1 89–98 (ERTRGRQP), Ara h 1 97–105 (GDYDDDRR), Ara h 1 107–116 (RREEGGRW), Ara h 1 123–132 (EREEDWRQ), Ara h 1 134–143 (EDWRRPSHQQ), Ara h 1 143–152 (PRKIRPEG), Ara h 1 294–303 (PGQFEDFF), Ara h 1 311–320 (YLQEFSRN), Ara h 1 325–334 (FNAEFNEIRR), Ara h 1 344–353 (QEERGQRR), Ara h 1 393–402 (DITNPINLRE), Ara h 1 409–418 (NNFGKLFEVK), Ara h 1 461–470 (GNLELV), Ara h 1 525–534 (ELHLLGFGIN), Ara h 1 539–548 (HRIFLAGDKDA), Ara h 1 551–560 (IDQIEKQAKDA), Ara h 1 559–568 (KDALAFPGSGE), Ara h 1 578–587 (KESHFVSARP) y Ara h 1 597– 606 (EKESPEKED). Utilizando una matriz (array) de 213 péptidos de 20 aminoácidos con un traslape de 5 residuos de las secuencias de Ara h1, Ara h2 y Ara h3, se encontró que Ara h1 contiene 13 regiones ligadoras de IgE prominentes, incluyendo un nuevo epítope comprendiendo los residuos 361-385, que no pudo ser encontrado utilizando el suero.

Ara h 2

Otro alérgeno significativo identificado en el cacahuate es Ara h 2, que es una glicoproteína con masa molecular de 17-19 kDa y un punto isoeléctrico de 5.2. Actualmente, se han identificado 2 isoformas de Ara h2. Ara h 2 corresponde a delta conglutina, un miembro de la familia 2S albúmina. El modelado molecular basado en homología de Ara h 2 y otros alérgenos de 2S albúmina mostró que comparten un armazón estructural tridimensional común, formado por 5 α-hélices arregladas en una superhélice con giro a la derecha y conecta por rizos más o menos extendidos. La estructura tridimensional es estabilizada por puentes disulfuro, los cuales están conservados entre todos los miembros de la superfamilia 2S albúmina. Ara h 2 difiere de otras 2S albúminas por 2 rizos adicionales en los extremos N-terminal y C-terminal de la cadena de polipéptido, respectivamente.

Se han definido 10 epítopes lineales de Ara h 2, como sigue: 15-HASARQQWEL-24, 21-QWELQGDR-28, 27-DRRCQSQLER-36, 39-LRPCEQHLMQ-48, 49-KIQRDEDS-56, 59-RDPYSP-64, 65-SQDPYSPS-72, 118-LQGRQQ-122, 127-KRELRN-132 y 143-QRCDLDVE-150.

Los epítopes han mostrado una bastante buena exposición en la superficie molecular del modelo tridimensional, pero el análisis conformacional de los epítopes lineales no muestra homología estructural de Ara h 2 con las regiones correspondientes de otros alérgenos de las nueces. Se ha sugerido que la reactividad cruzada alergénica observada entre el cacahuate y los alérgenos de las nueces depende de otra proteína de almacenamiento ubicua de la semilla, la vicilina. Sin embargo, los estudios recientes empleando alérgeno Ara h 2 recombinante indican que el alérgeno  del cacahuate específico para la IgE reacciona de forma cruzada con las proteínas presentes en la almendra y la nuez de Brasil. Como un correlativo in vitro de reactividad clínica, se empleó el ensayo de activación de basófilo para demostrar que Ara h 2 comparte epítopes ligadores de IgE comunes con algunos alérgenos de las nueces. Casi con seguridad hay epítopes espaciales que no fueron considerados previamente. La presencia de estos epítopes ligadores de IgE comunes puede contribuir a la prevalencia de co-sensibilización al cacahuate y a las nueces en los individuos alérgicos al cacahuate.

Ara h 3 y Ara h 4

Los restantes alérgenos que aparecen en los cacahuates son menos significativos. Dos de ellos son Ara h 3 y Ara h 4, cuyas secuencias son idénticas en un 91% pero que fueron nombrados independientemente (normalmente serian llamados isoalérgenos). Estos alérgenos son proteínas de almacenamiento de la semilla, que perteneces a la superfamilia 11S cupina.

La globulina de almacenamiento 11S del cacahuate, llamada araquina, es un oligómero con masa molecular de 360 kDa. Como otras leguminas y glicininas, es sintetizada como cadenas de polipéptidos de unos 60 kDa, los cuales forman trímeros. En la separación en subunidades ácidas N-terminal de 40 kDa y subunidades básicas C-terminal de 20 kDa, que permanecen unidas por puente disulfuro, los trímeros forman un hexámero. Una cadena acídica y una básica en la subunidad son separados por un enlace peptídico Asn-Gly. Es posible que araquina sea, como otras proteínas globulinas de almacenamiento, termoestable.

Ara h 3 fue originalmente identificado como una glicinina. Sin embargo, resultó que esta proteína de 14 kDa era una forma procesada de Ara h 3, luego de la traducción de la proteína entera esperada. Actualmente se asume que Ara h 3 contiene varios polipéptidos, los cuales en SDS-PAGE de un extracto de proteína de nuez son visibles dentro del rango de masa molecular de 14-45 kDa. Los modelos tridimensionales construidos a partir de las coordenadas de rayos-X de la glicinina A3B4 de soya (PDB código 10D5) realizados para Ara h 3 y otros alérgenos de leguminosas en las nueces (Ana o 2, Bre e 1, Cor a 9 y Jug r 4) han demostrado que todos estos alérgenos contienen un motivo cupina hecho de 2 módulos arreglados en tándem, relacionados por un eje seudosimétrico. En cada módulo, dos paredes de β-filamentos antiparalelos formando la estructura central del módulo se asocian a un rizo extendido conteniendo tres α-hélices. Ambos módulos están conectados por una región ligadora formada por 2 alargamientos de α-hélice para formar el promotor de legumina. Los tres motivos cupina forman un homotrímero en forma de prisma, similar al de otras leguminosas.

Se han reportado 4 epítopes ligadores de IgE críticos (IETWNPNNQEFECAG 33–47, GNIFSGFTPEFLEQA 240–254, VTVRGGLRILSPDRK 279–293, DEDEYEYDEEDRRRG 303–317), todos en la región de la N-terminal de Ara h 3 y por tanto en la subunidad ácida de 40 kDa. Un estudio reciente ha demostrado que una subunidad básica de Ara h 3 contiene inmunorreactividad dominante. Ara h 3 exhibe 62%-72%  de identidad secuencial con homólogos de la soya y el chícharo. Se ha encontrado que Ara h 3 tiene una mayor homología de secuencia de aminoácidos con la soya y otras proteínas LegA que con la G4  y otras 11S globulinas de la soya. El epítope que une de manera cruzada a la IgE del cacahuate y la soya ha sido reportado como SGFTPEFLEQAFQVD (Ara h 3 244–258).

Los análisis de conformación han mostrado que los epítopes ligadores a IgE expuestos en la superficie en Ara h 3 exhiben alguna homología estructural susceptible de dar cuenta por la reactividad cruzada ligadora a IgE, observada entre los alérgenos del cacahuate y las nueces (Jug r 4 de la nuez de Castilla, Cor a 9 de avellana y Ana o 2 de nuez de la India). Los epítopes ligadores a IgE similares a estos encontrados en los alérgenos 11S globulinas aparentemente no aparecen en otros alérgenos de vicilina con el doblez cupina del cacahuate (Ara h 1) o las nueces (Jug r 2 de la nuez de Castilla, Cor a 1 de avellana y Ana o 3 de nuez de la India).

Ara h 5

Ara h 5 es un alérgeno del cacahuate con masa molecular de 14 kDa y una alta termoestabilidad. Este alérgeno menor es una proteína ligadora de actina del citoesqueleto y corresponde al bien conocido alérgeno de plantas llamado profilina, al exhibir hasta el 80% de la secuencia de aminoácidos identificados en otras profilinas. Se ha encontrado que la profilina del cacahuate tiene reacción cruzada con la profilina de la cereza (Pru a 4) y menos fuertemente con las profilinas en la pera y el apio, mientras que la profilina del polen del abedul (Bet v 2) no fue capaz de inhibir la unión de IgE a la profilina del cacahuate. La secuencia de Ara h 5 muestra una identidad 83% similar a la de Gly m 3 de la soya. La profilina recombinante del cacahuate fue purificada de E. coli utilizando una columna Sepharosa de poly-L-prolina.

Ara h 6 y Ara h 7

Otros dos alérgenos menores del cacahuate, Ara h 6 y Ara h 7 pertenecen, como Ara h 2, a la familia de 2S albúmina. Mientras que el Ara h 2 homólogo es considerado un alérgeno importante, Ara h 6 es considerado solo menor, reconocido por 38% del suero alérgico al cacahuate, mientras que Ara h 7 es reconocido por el 43% del suero alérgico al cacahuate.

Ara h 6 es aproximadamente 60& idéntico a Ara h 2 y es por tanto tratado como un alérgeno diferente más que como un isoalérgeno. Sin embargo, puede ocurrir alguna reactividad cruzada con IgE. Ara h 6 rinde un núcleo resistente a proteasa en digestión con tripsina y quimotripsina. Ara h 7 puede ser menos estable que Ara h 2 y Ara h 6 porque solamente están conservados 2 puentes disulfuro. Ara h 2 y Ara h 6 son 40%-50% idénticas a Ara h 7 a través del 80% de la secuencia. No queda claro si existe una reactividad cruzada a IgE.

Ara h 8

Ara h 8 es una proteína monomérica con masa molecular de 17 kDa, que pertenece a la familia Bet v 1. Otros alérgenos del cacahuate, como Ara h 2, Ara h 5, Ara h 6 y Ara h 7 tienen masas moleculares de 14-18 kDa, lo que hace difícil identificar a las proteínas alergénicas en inmunoblots (Western blot) incubados con suero de sujetos alérgicos. Ara h 8 puede ser una proteína relacionada a patogénesis debido a que su secuencia es idéntica con varias proteínas PR-10 “bona fide”. Su función precisa se desconoce pero puede ser una proteína ligadora de esteroides, tal como es Bet v 1. Ara h 1 es un importante alérgeno para los pacientes con alergias concurrentes al polen del abedul y al cacahuate. Se ha logrado expresar Ara h 8 en E. coli; el Ara h 8 recombinante tiene una estructura secundaria similar a los Gly m 4 y Bet v 1 recombinantes. El alineamiento de secuencia reveló una identidad de secuencia de aminoácidos de 459% con Bet v 1 y de 70.6% con Gly m 4. Se ha reportado que Ara h 8 muestra baja estabilidad a la digestión por pepsina, de forma similar a la baja estabilidad a la digestión gástrica encontrada en otros alérgenos relacionados a Bet v 1, tales como Mal d 1 o Cor a 1. Esto podría explicar por qué las reacciones alérgicas en la mayoría de los sujetos estudiados estuvieron restringidas a la cavidad oral y podría minimizar la probabilidad de sensibilización a Ara h 8 a través del tracto gastrointestinal.

Oleosina

El último alérgeno identificado en el cacahuate es oleosina, con masa molecular de 16-17 kDa. Las oleosinas son los componentes proteínicos de los cuerpos de almacenamiento lípido de las plantas, conocidos como “cuerpos de aceite”. Las oleosinas son proteínas anfipáticas de bajo peso molecular (15-26 kDa) con un núcleo hidrofóbico largo, flanqueado por dominios hidrofílicos en N-terminal y C-terminal, que actúan como emulsificadores para el almacenamiento de lípidos en las semillas. Al refinar la oleosina de cacahuate, se ha revelado la predominancia de la estructura en α-hélice, que puede ser asignada a la región central. Es normal referirse a la oleosina como un alérgeno oculto, que podría ser la causa de hipersensibilidad luego del consumo de aceite refinado de cacahuate o productos conteniendo este aceite. La reactividad de la oleosina con IgE se incrementa en los cacahuates tostados.

El tratamiento tecnológico aplicado durante el procesamiento de los alimentos puede resultar en cambios en las propiedades alergénicas de los mismos. Las reacciones térmicas como el tostado, curado y varios tipos de cocción pueden causar múltiples reacciones bioquímicas no enzimáticas en el alimento. Una de las reacciones más comunes durante el tratamiento térmico es el grupo llamado reacciones de Maillard; el producto final de estas reacciones juega un papel significativo en la formación del aroma y el sabor de productos alimentarios. Los cacahuates son con frecuencia sometidos a tostado, lo que contribuye a incrementar la alergenicidad de sus principales alérgenos.

Tanto Ara h 1 como Ara h 2 de los cacahuates tostados se unen a mayores niveles de IgE. Se ha identificado una correlación entre el nivel del incremento en la unión a IgE y el incremento en las modificaciones de carboximetil-lisina en la superficie de la proteína. El extracto obtenido del cacahuate tostado reacciona con el suero de sujetos alérgicos en un nivel 90 veces más alto que el observado con el cacahuate crudo. El tostado resulta en la formación de trímeros altamente estables de Ara h 1. Ara h 1 purificado de cacahuates tostados es mucho menos soluble que Ara h 1 de cacahuates crudos. Se cree que Ara h 2 forma entrecruzamientos intramoleculares debido al tostado, sin formar estructuras de orden superior.

Por años se ha sabido que Ara h 2 es un débil inhibidor de tripsina. La actividad inhibidora de tripsina en Ara h 2 se incrementa 3.5 veces con el tostado. El proceso también incrementa la resistencia de Ara h 2 a la digestión por tripsina. Ara h 2 nativo, pero no el reducido, es resistente a proteasas, dejando un fragmento de 10 kDa. También se ha observado que Ara h 2 protege a Ara h 1 contra la acción de la tripsina, además de que la intensidad de la protección aumenta luego del tostado. Sin embargo, la estructura de la proteína es alterada, posiblemente con entrecruzamientos intramoleculares. La unión de Ara h 2 a IgE también sobrevive mejor al tostado que al hervido o el freído.  La unión de profilina (Ara h 5) a IgE también sobrevive al tostado.

Ara h 8 tiene baja resistencia al tostado, pero no es totalmente inactivado por el calor. Se ha demostrado dicha resistencia térmica parcial para otros alérgenos alimentarios que son homólogos a Bet v 1, como Cor a 1 de la avellana o Gly m 4 de la soya.

El aceite de cacahuate es ampliamente utilizado en productos farmacéuticos (entre otros para la producción de ungüentos y vitaminas) o como adhesivo óseo para cirugías ortopédicas. Los resultados de ELISA muestran que solamente el aceite crudo de cacahuate contiene cantidades significativas de proteína, mientras que en los aceites refinados y los productos farmacéuticos no hay proteína detectable (por debajo de 0.3 ng/ml); en inmunoblots con suero de sujetos alérgicos al cacahuate, no se ha encontrado reactividad. Aun así, aparece una nueva tendencia en la producción de aceites comestibles. En general, los aceites crudos de plantas contienen numerosos compuestos bioactivos que son removidos en la refinación y las nuevas tecnologías están dirigidas a incrementar el valor nutritivo de los aceites comestibles. El tiempo mostrará las repercusiones  de esta y otras tendencias en la población con alergia al cacahuate y otros alimentos.