Regulación de la expresión génica por aminoácidos

Los mamíferos deben ajustar su metabolismo al consumo intermitente de alimento. Adicionalmente, deben adaptarse a cambios metabólicos internos como el ciclo menstrual o embarazo in las hembras y el crecimiento de tejidos en los jóvenes. Todos estos factores internos y externos demandan respuestas metabólicas y mecanismos reguladores asociados. La regulación del metabolismo se alcanza por acciones coordinadas entre tejidos y células. Estos mecanismos involucran la regulación condicional de genes específicos en la presencia o ausencia de nutrimentos apropiados. En los organismos multicelulares, el control de la expresión génica involucra interacciones complejas de factores hormonales, neuronales y nutricionales.

El control de la expresión génica por la disponibilidad de nutrimentos ha sido bien documentado en procariontes y eucariontes menores. Estos organismos son capaces de ajustar su capacidad metabólica a variaciones en el abasto de nutrimentos, alterando su patrón de expresión génica. Por ejemplo, el operón lac de Escherichia coli y el regulon gal de Saccharomyces cerevisiae están entre las rutas reguladoras de expresión génica mejor entendidas.

Aunque no completa o ampliamente apreciado, las señales nutricionales juegan un importante papel en el control de expresión génica en mamíferos. Se ha demostrado que los componentes dietarios mayores (carbohidratos, ácidos grasos, esteroles) y menores (vitaminas, minerales) participan en la regulación de la expresión de los genes. Sin embargo, los mecanismos involucrados en el control de la expresión génica por los aminoácidos apenas comienza a ser entendida para las células mamíferas.

 

Regulación del metabolismo de aminoácidos y homeostasis en el animal como un todo

Los mamíferos deben regular con precisión la homeostasis de aminoácidos, mientras toman en cuenta 2 importantes características del metabolismo de aminoácidos: 1) los organismos multicelulares son incapaces de sintetizar todos los aminoácidos, y 2) no hay importantes reservas de aminoácidos de las cuales echar mano (en contraste con los lípidos o la glucosa).

El tamaño de la poza de cada aminoácido es el resultado de un balance entre lo que entra y lo que es removido. Las salidas metabólicas para aminoácidos son la síntesis de proteínas y la degradación de aminoácidos, mientras que las entradas son la síntesis de novo (para los aminoácidos no esenciales), la degradación de proteínas y el consumo dietario. Cambios en las tasas de estos sistemas llevan a un ajuste en el balance de nitrógeno. Por ejemplo, la homeostasis de aminoácidos y el metabolismo de proteínas pueden ser alterados en respuesta a la desnutrición y/o varias formas de trauma como sepsis, fiebre, quemaduras térmicas, etc., con 2 consecuencias principales: una gran variación en la concentración de aminoácidos en sangre y un balance negativo de nitrógeno. En estas situaciones, los individuos deben ajustar varias funciones fisiológicas que están involucradas en la defensa y adaptación de la limitación de aminoácidos mediante la regulación de numerosos genes.

Nutrición insuficiente de proteínas

Alimentarse por tiempo prolongado con una dieta baja en proteínas causa una disminución en los niveles plasmáticos de la mayoría de los aminoácidos esenciales. Por ejemplo, en plasma de niños afectados por kwashiorkor, la concentraciones de leucina y metionina pueden reducirse de 100-150 µM y 18-30 µM, a alrededor de 20 µM y 5 µM, respectivamente. Consecuentemente, los individuos deben ajustar varias funciones fisiológicas para adaptarse a esta deficiencia de aminoácidos. Tanto en niños como en animales jóvenes, la principal consecuencia de consumir una dieta baja en proteínas es la dramática inhibición del crecimiento.

Se ha demostrado que la inhibición del crecimiento se debe a una fuerte sobreexpresión de la proteína ligadora de factor de crecimiento tipo insulina 1 (IGFBP-1), la cual liga factores de crecimiento tipo insulina 1 y 2, mientras modula sus propiedades mitogénicas (estimuladoras del ciclo celular) y metabólicas. La expresión de IGFBP-1 es regulada por la hormona del crecimiento, insulina o glucosa; sin embargo, los altos niveles de IGFBP-1 asociados con una dieta deficiente en proteína no puede ser explicada solamente por estos 3 factores. Se sabe que una disminución en la concentración de aminoácidos es directamente responsable de la inducción de IGFBP-1. Por lo tanto, la limitación de aminoácidos como la que sucede con una dieta deficiente en proteínas participa en la regulación a la baja del crecimiento por la inducción de la expresión de IGFBP-1.

 

Dieta desbalanceada

Como los animales no pueden sintetizar todos los aminoácidos, la dieta debe proveer aquellos que no son sintetizados. Así, en el caso de una deficiencia de uno de los aminoácidos indispensables, el resto de los aminoácidos son catabolizados y perdidos, y las proteínas corporales se rompen para proveer el aminoácido limitante. La capacidad para distinguir el balance del desbalance entre los aminoácidos en la dieta y para seleccionar los aminoácidos esenciales que limitan el crecimiento, proporciona una ventaja adaptadora a los animales.

Después de alimentarse con una dieta desbalanceada en aminoácidos, un animal reconoce primero la deficiencia de aminoácidos y luego desarrolla una aversión condicionada al gusto. El reconocimiento y la anorexia que resultan de una dieta desbalanceada en aminoácidos tienen lugar muy rápido. Los mecanismos detrás del reconocimiento de la calidad de una proteína deben actuar a través de aminoácidos libres que resultan de la digestión intestinal de las proteínas.

Se ha observado que un marcado decremento en la concentración en sangre del aminoácido limitante se vuelve aparente en unas cuantas horas de haber consumido una dieta desbalanceada. La respuesta anoréxica está bien correlacionada con una menor concentración del aminoácido limitante en plasma.

Varias líneas de investigación sugieren que la disminución de la concentración de aminoácido limitante se detecta en el cerebro. Un área específica del cerebro, la corteza piriforme anterior, puede sentir la concentración de aminoácidos. Esta fase de reconocimiento está asociada con disminuciones localizadas en la concentración del aminoácido limitante y con importantes cambios en la tasa de síntesis de proteínas y en la expresión génica. Luego del reconocimiento de la deficiencia, la segunda etapa, desarrollo de la anorexia, involucra otra parte del cerebro.

 

Estos 2 ejemplos demuestran que variaciones en las concentraciones de aminoácidos pueden activar varios procesos de control en las células objetivo (diana, target) que pueden regular específicamente la expresión de los genes objetivo.

Aunque el papel de los aminoácidos que son considerados como reguladores de la expresión génica se ha entendido parcialmente en algunas situaciones nutriológicas, se han hecho avances en el entendimiento de los mecanismos por los cuales la limitación de aminoácidos controla la expresión de varios genes.

 

Control de la expresión génica por los aminoácidos

Aunque los mecanismos moleculares involucrados en el control de la expresión génica por la disponibilidad de aminoácidos están comenzando a ser estudiados en mamíferos, estos mecanismos han sido ampliamente estudiados en levaduras.

 

Control de la expresión génica en lavaduras

En levaduras se han descrito varios sistemas sensores de aminoácidos.

 

Procesos de control específico

Está bien documentado que numerosos operones son regulados por productos finales específicos de las enzimas correspondientes. Una pequeña molécula efectora puede inducir la transición de activadores transcripcionales de la forma inactiva a la forma activa. Por ejemplo, la biosíntesis de leucina es controlada por el activador transcripcional Leu3p en respuesta a la disponibilidad de leucina. Leu3p es activado por los niveles del intermediario metabólico α-isopropilmalato, el cual sirve como un sensor de la disponibilidad de leucina. Este tipo de regulación ha sido descrita para el control del catabolismo de aminoácidos como la prolina.

 

Proceso de control general. Ruta de la GCN2 proteína quinasa

Además del control específico, las levaduras utilizan un proceso de control general en donde un subjuego de genes es inducido coordinadamente por el “hambre” de una célula por un único aminoácido. El tRNA libre se acumula y así estimula la actividad de la GCN2 proteína quinasa, que fosforila la subunidad alfa del factor de iniciación eucariótica 2 (eIF2) y en cambio impide la síntesis del complejo de preiniciación 43S (met-tRNA-GTP-eIF2).

A pesar de la fuerte inhibición de la síntesis proteínica, el factor de transcripción GCN4 es regulado a la alza traduccionalmente. Este control es debido a la estructura de la región sin traducir (URT) 5’ del mRNA GCN4. Como resultado, GCN4 induce más de 30 genes diferentes que están involucrados en diferentes rutas biosintéticas.

 

La ruta de objetivo de rapamicina

La ruta de objetivo de rapamicina (TOR) es regulada por la disponibilidad de aminoácidos y está involucrada en la regulación de varios procesos celulares como la traducción, transcripción y degradación de proteínas. Los mecanismos moleculares involucrados en el control de la actividad TOR por aminoácidos no se han comprendido del todo.

 

El complejo Ssy1p-Ptr3p-Ssy5p

Avances en el entendimiento de los sensores de nutrimentos indican que las células de levadura poseen un sistema sensor de aminoácidos localizado en la membrana plasmática, que transduce información referente a la presencia de aminoácidos extracelulares. El sensor primario de aminoácidos es un complejo multimérico de 3 proteínas, SSyl1-Ptr3p-Ssy5p (llamado complejo SPS).

El componente SSy1p recuerda a una aminoácido-permeasa, familia de proteínas que normalmente cataliza el transporte de aminoácidos hacia el interior de la célula. En respuesta a un cambio en la disponibilidad de aminoácidos, una red compleja de procesos reguladores es activada por Ssy1p  para modificar la expresión de los genes objetivo (diana, target). El complejo SPS se requiere par la inducción de un juego de genes objetivo (BAP3, TAT2, CHA1, etc.) por aminoácidos y es también requerido para la represión aminoácida de otro juego de genes objetivo (DAL4, MET3, MMp1, etc.)

 

Control de la expresión génica en las células de mamíferos

Genes estimulados por abundancia de aminoácidos

Los genes que son específicamente regulados a la alza en respuesta a concentraciones suprafisiológicas de aminoácidos han sido descritos, al menos parcialmente. Por ejemplo, una alta concentración de L-triptófano mejora la expresión de colagenasa e inhibidores tisulares de metaloproteinasa.  En los hepatocitos de rata, los aminoácidos cotransportados con Na+ como glutamina, alanina y prolina estimulan la actividad de acetil-CoA-carboxilasa, glucógeno sintetasa y argininosuccinato-sintetasa.

Se ha demostrado que la inflamación que resulta de la adición de aminoácidos podría estar involucrada en la regulación de la expresión génica. Sin embargo, los mecanismos moleculares de estos procesos son se han comprendido del todo.

 

Genes estimulados por la carencia de aminoácidos

En las células de mamífero, se han reportado algunos ejemplos de mRNA específico que son inducidos por la privación de aminoácidos. La mayoría de los mecanismos moleculares involucrados en la regulación de la expresión génica por aminoácidos han sido obtenidos en el estudio de la regulación a la alza de los genes de la proteína homóloga de proteína ligadora de potenciador/CCAAT (C/EBP) (CHOP), asparagina-sintetasa (AS) y el transportador catiónico de aminoácido (Cat-1).

 

Mecanismos moleculares involucrados en la regulación de la expresión génica por la limitación de aminoácidos

La regulación por aminoácidos de la mayoría de los genes regulados por aminoácidos tiene tanto componentes transcripcionales como post-transcripcionales.

 

Regulación post-transcripcional de expresión génica por la disponibilidad de aminoácidos

La tasa de traducción de genes específicos puede ser regulada por disponibilidad de aminoácidos. Se ha demostrado que la carencia de aminoácido inicia los eventos moleculares que específicamente activan la traducción del gen Cat-1, confirmando la presencia de un sitio de entrada interna del ribosoma (IRES), localizado dentro de la ‘5 UTR del mRNA de Cat-1. Este IRES está involucrado en el control aminoácido de la traducción del transcripto Cat-1. Bajo condiciones de carencia de aminoácido, la traducción de este IRES es estimulada, mientras que la síntesis de proteína dependiente de CAP es disminuida.

Otro ejemplo es traducción inducida por falta de aminoácido se ha reportado para la α-cetoácido de cadena ramificada-deshidrogenasa-quinasa, pero el mecanismo de control traduccional no se ha estudiado a fondo. Este mecanismo de respuesta compensadora permite la traducción de proteínas importantes a pesar de la inhibición del aparato traduccional dependiente de CAP.

 

Activación transcripcional de los genes mamíferos por carencia de aminoácidos

Se ha establecido que el incremento en mRNA de CHOP o AS, luego de la falta de aminoácidos, es principalmente debido a un incremento en la transcripción.  Al identificar los elementos cis y luego los factores de transcripción correspondientes, responsables de estos genes objetivo específicos, se anticipa que se puede progresar hacia atrás en la ruta de transducción para entender las etapas individuales requeridas.

 

Regulación del gen CHOP humano por carencia de aminoácidos

CHOP codifica un factor de transcripción ubicuo que se heterodimeriza ávidamente con los otros miembros de las familias C/EBP y Jun/Fos. El gen CHOP es estrechamente regulado por una amplia variedad de factores de estrés en las células mamíferas. La limitación de leucina en células humanas lleva a la inducción de mRNA y proteína de CHOP en una manera dosis-dependiente.

Se ha identificado en el promotor CHOP un elemento cis-positivo localizado entre los residuos -313 y -295 que es esencial para la regulación aminoácida del promotor CHOP. Esta corta secuencia puede regular un promotor basal en respuesta a la carencia de varios aminoácidos individuales por lo que puede ser llamada elemento regulador de aminoácido (AARE). La secuencia de la región AARE CHOP muestra alguna homología con los sitios de unión específicos de las familias de factor de transcripción C/EBP y proteína ligadora del elemento de respuesta del factor de transcripción activador (ATF)/adenosina-5’monofosfato cíclico.

Muchos factores de transcripción que pertenecen a la familia ATF o C/EBP tienen la habilidad de unirse in vitro al AARE CHOP. Entre estos factores, al menos ATF-2 y ATF-4 están involucrados en el control de la expresión de CHOP por aminoácidos; cuando líneas celulares noqueadas para estas 2 proteínas son sometidas a prueba, la regulación aminoácida de la expresión CHOP es abolida. Estudios adicionales han confirmado que ATF-2 y ATF-4 son componentes clave del control de la expresión génica por aminoácidos.

 

Regulación de AS por la disponibilidad de aminoácidos

AS es expresada en la mayoría de las células mamíferas como una enzima de mantenimiento, responsable de la biosíntesis de asparagina a partir de aspartato y glutamina. Los niveles de mRNA de AS se incrementan no solamente en respuesta a la carencia de asparagina sino también por la falta de leucina, isoleucina o glutamina.

Se ha analizado la regulación del promotor AS por la disponibilidad de aminoácidos, caracterizando una unidad reguladora sensible a nutrimentos que incluye 2 elementos actuadores cis, llamados elementos de respuesta sensibles a nutrimentos (NSRE-1 y NSRE-2) que son requeridos para inducir la expresión AS por la falta de algún aminoácido o por la respuesta de estrés del retículo endoplásmico (ER, por sus siglas en inglés). Experimentos de retardo en gel (gel-shift) y sobreexpresión de mutantes dominante negativo sugieren que la activación del gen AS por limitación de aminoácido o respuesta al estrés de ER involucra unión de ATF-4 y C/EBP-β al sitio NSRE-1.

La comparación entre los elementos de control transcripcional CHOP y AS muestra que NSRE-1 de AS y AARE de CHOP comparten secuencias de nucleótidos y similitudes funcionales.  Sin embargo, los AARE CHOP pueden funcionar solos, mientras que NSRE-1 de AS es funcionalmente débil por si mismo y requiere la presencia de NSRE-2. El NSRE-2 tiene 2 propiedades: 1) amplifica la actividad de NSRE-1 en respuesta a la falta de aminoácido, y 2) confiere una respuesta al estrés ER. Por ejemplo, cuando se clona rio abajo (downstream o hacia el extremo 3’) de AARE CHOP, se confiere sensibilidad a estrés ER al AARE CHOP.

 

Ruta señalizadora de aminoácidos

Parece ser que las células mamíferas tienen más de una ruta de señalización de aminoácidos, independiente de la ruta de estrés ER. Sin embargo, las etapas requeridas por estas rutas no se comprenden del todo.

 

ATF-4 y las rutas señalizadoras de aminoácidos

Varias investigaciones han revelado una ruta señalizadora para regular la expresión génica en mamíferos que es homóloga a la bien caracterizada respuesta de control general a la carencia de aminoácido en levadura. Estos componentes incluyen el homólogo mamífero a la GCN2-quinasa, eIF2α y ATF-4. Como el transcripto GCN4, el mRNA de ATF-4 contiene un marco de lectura abierto rio arriba (upstream o hacia el extremo 5’) en su 5’ UTR que permite la traducción cuando la traducción dependiente de CAP es inhibida. Se ha demostrado que la activación de GCN2, la fosforilación de eIF2α y la activación traduccional de ATF-4 son necesarias pero no suficientes para la inducción de la expresión CHOP en respuesta a la falta de leucina. Estos datos concuerdan con el análisis del promotor CHOP y AS, al mostrar que ATF-4 puede unirse a las secuencias promotoras involucradas en la respuesta a la carencia de aminoácidos.

 

ATF-2 y las rutas señalizadoras de aminoácidos

La capacidad transactivadora de ATF-2 es activada vía fosforilación de los residuos N-terminales Thr-69, Thr-71 y Ser-90. Hay líneas de evidencia que sugieren que la fosforilación de ATF-2 pertenece a la ruta de respuesta de aminoácido que lleva a la activación transcripcional de CHOP por aminoácidos: 1) la carencia de leucina induce la fosforilación de ATF-2 en  las líneas celulares humanas; y 2) un mutante dominante negativo ATF-2, en el cual los 3 residuos no pueden ser fosforilados, inhibe la actividad del promotor CHOP potenciado por la falta de leucina. Estos datos sugieren que una ruta específica regulada por aminoácido que lleva a la activación transcripcional de CHOP puede involucrar una fosforilación de ATF-2 pre-unida, más que un incremento a la unión de ATF-2. Sin embargo, la identidad de las quinasas involucradas en la fosforilación ATF-2 por falta de aminoácidos debe ser confirmada.

Parece que al menos 2 diferentes rutas metabólicas que llevan a la fosforilación de ATF-2 y la expresión de ATF-4 son necesarias para inducir la expresión CHOP en respuesta a un estímulo (carencia de aminoácido). Adicionalmente, ATF-2 y ATF-4 pertenecen a la familia de factores de transcripción cremallera de leucina básica (bZIP). Estas proteínas tienen la habilidad de interactuar con varios factores de transcripción para unirse a la secuencia objetivo del DNA. En el caso de la regulación de la expresión de CHOP por aminoácidos, no hay evidencia firme de que ATF-2 y ATF-4 formen un dímero que inhiba la secuencia AARE, pero podrían ser incluidos en un gran complejo proteínico regulador. Por ejemplo, se ha confirmado que ATF-2 interactúa con por lo menos 2 factores de transcripción (CP1 y NF1) en un gran complejo proteínico, para regular la transcripción del gen de fibronectina.

 

En conclusión, la idea de que los aminoácidos pueden regular la expresión génica está bien establecida. Los aminoácidos por si mismos pueden jugar, en concierto con las hormonas, un importante papel en el control de la expresión de los genes; sin embargo, los procesos subyacentes comienzan a ser descubiertos.

La disponibilidad de aminoácidos puede modificar la expresión de genes objetivo, al nivel de transcripción, estabilidad de mRNA y traducción.

Definir la cascada precisa de eventos moleculares por los cuales la concentración celular de un aminoácido individual regula la expresión génica será una importante contribución a nuestro entendimiento del control metabólico en las células mamíferas. Estos estudios proporcionan, una pieza a la vez, claridad sobre el papel de los aminoácidos en la regulación de las funciones celulares como división celular, síntesis proteínica o proteólisis.