La miRómica aplicada a la Nutrigenómica

El campo de la interacción nutrimento-gen se ha desdoblado gradualmente durante la última década, estableciéndose como piedra angular clave en la investigación nutriológica. Los estudios se han enfocado en los genes que codifican proteínas cuya función es de interés en la salud y en la enfermedad. Los genes no codificadores, a los que con frecuencia se refiere como “DNA de desperdicio” (también conocido como DNA junk) no ha sido de mucho interés. Los tiempos han cambiado, y lo que solía ser “desperdicio” ahora ocupa un lugar central en el interés de los investigadores. El dogma central en biología molecular ignoraba una parte significativa del código genético, la cual permaneció bajo un velo por décadas. Los genes del RNA no codificador (ncRNA, por sus siglas en inglés) producen moléculas de RNA funcionales más que codificadoras de proteínas. Varias revisiones sistemáticas han identificado un número sorprendentemente alto de genes ncRNA. El ncRNA parece ser particularmente abundante en papeles que requieren reconocimiento de ácido nucleico altamente específico sin catálisis compleja, tales como en direccionar la regulación post-transcripcional de la expresión génica o en guiar modificaciones al RNA.

Aunque se asume generalmente que la mayoría de la información genética es tramitada por proteínas, evidencia reciente sugiere que la mayoría de los genomas de mamíferos y otros organismos complejos son de hecho transcritos en ncRNAs, muchos de los cuales son alternativamente divididos y/o procesados en productos más pequeños. Estos RNAs (incluyendo aquellos derivados de intrones) parecen comprender una capa hasta ahora oculta de señales internas que controlan varios niveles de expresión génica en fisiología y desarrollo, incluyendo arquitectura de cromatina/memoria epigenética y transcripción, así como división, edición, traducción y acreción de RNA. Esta capa oculta de señales internas ahora emerge para ser de significancia crítica, al grado que la falta de consideración de dicha capa implica un serio riesgo de nublar nuestra habilidad para entender las bases moleculares de la salud y la enfermedad.

El silenciado génico post-transcripcional (PTGS, por sus siglas en inglés), que fue visto inicialmente como un mecanismo regulador aislado en algunas especies de plantas, represente actualmente una importante frontera en la medicina molecular. El RNA de interferencia (RNAi, por sus siglas en inglés) fue observado inadvertidamente por primera vez en un experimento para incrementar el pigmento púrpura de las petunias. Sin embargo, el experimento reventó cuando el gen introducido causo PTGS del gen productor de pigmento. Estudios subsecuentes en C. elegans y en la mosca Drosophila sp. revelaron que el PTGS podría ser disparado por DNA de doble cadena (dsDNA, por sus siglas en inglés). Un fenómeno similar en hongos fue denominado “la calma”, a principios de los 1990s.

Fire y Mello fueron acreditados con el descubrimiento del RNAi en 1998. Los trabajos tempranos habían identificado que tanto en RNA antisentido como el RNA sentido podían silenciar los genes, aunque los resultados eran inconsistentes y los efectos eran usualmente modestos. A la luz de la observación de que tanto el RNA sentido como antisentido podían causar el silenciado, Mello argumentó que el mecanismo no podía ser solamente un apareamiento de RNA antisentido al RNA mensajero (mRNA, por sus siglas en inglés), creando el término RNAi para el mecanismo desconocido. El descubrimiento de que el RNA corto es el efector de RNAi fue rápidamente seguido por la identificación de una clase de moléculas de RNA endógenas del mismo tamaño en gusanos, moscas, ratones y humanos. Este pequeño RNA fue llamado microRNA (miRNA, por sus siglas en inglés). En todas las formas de vida, ncRNA incluye RNA ribosómico (rRNA, por sus siglas en inglés), RNA de transferencia (tRNA, por sus siglas en inglés), RNA pequeño nuclear (snRNA), RNA pequeño nucleolar (snoRNA, por sus siglas en inglés), RNA de interferencia (RNAi), RNA corto de interferencia (siRNA, por sus siglas en inglés) y microRNA (miRNA o miR).

Los miRNAs son poderosos reguladores de la expresión génica. Se estima que alrededor del 3% de los genes humanos codifican para miRNAs. Un miRNA tiene aproximadamente 22 ribonucleótidos de largo, RNAs no codificadores, con potencial para reconocer múltiples objetivos (targets) mRNA, guiados por complementariedad de secuencia y proteínas ligadoras de RNA. La evidencia reciente sugiere que el número de genes miRNA únicos en humanos excede el millar. El número de miRNAs y sus objetivos son muchos más que los que se pensaba previamente. Los miRNAs son funcionalmente versátiles, con la capacidad para inhibir específicamente la iniciación o elongación de la traducción, así como inducir la desestabilización de mRNA, a través de predominantemente atacar las regiones 3’ no traducidas del mRNA. Brevemente, los miRNAs son transcritos en el núcleo por mecanismos convencionales y exportados al citoplasma, en donde luego del procesamiento biológico forman el miRNA maduro que puede interactuar con los mRNAs apropiados (nucleótidos correctos) por unión RNA-RNA; esta unión, con la ayuda del complejo silenciado inducido por RNA (RISC, por sus siglas en inglés) lleva a modos de acción, resultando en la degradación o inhibición traduccional del mRNA. Este mecanismo de acción se denomina regulación génica post-transcripcional (PTGS, por sus siglas en inglés).

En los animales, a diferencia de las plantas, no hay un emparejamiento completo de nucleótidos entre un miRNA y su mRNA objetivo, llevando a un modo de acción que causa la inhibición traduccional del mRNA y no a la degradación del mRNA. La interacción entre el miRNA y su mRNA ocurre entre la región no traducida 5’ (UTR 5’, por sus siglas en inglés) del miRNA y la región no traducida 3’ (UTR 3’, por sus siglas en inglés) del mRNA por un elemento semilla de emparejamiento en el miRNA. Utilizando estos datos, los acercamientos de predicción computacional estiman que los miRNAs pueden atacar hasta 30% del genoma humano. Otros estimados indican que más del 50% de los genes humanos codificadores de proteínas podrían ser regulados por miRNAs. Adicionalmente, un miRNA puede regular cientos de genes, y un gene puede ser regulado por varios miRNAs.

La primera etapa en cualquier expresión génica es la transcripción. Inicialmente se creía que la transcripción del miRNA estaba mediada por RNA polimerasa III, porque transcribe la mayoría de los RNAs pequeños. Sin embargo, los pri-miRNAs (ver en seguida este concepto) son algunas veces de varias kilobases de largo y contienen estiramientos de más de 4 uracilos, lo que terminaría la transcripción por polimerasa III. Se ha concluido que la transcripción de miRNA es lograda por RNA polimerasa II. El miRNA es primer transcrito como un precursor de miRNA de cientos o miles de nucleótidos (nt) de largo denominado miRNA primario (pri-miRNA, por sus siglas en inglés). Los análisis de varios precursores pri-miRNA han mostrado que todos contienen un tope 5’ 7-metilo-guanosina y una cola 3’ poli-adenosina (poli-A). Por lo tanto, estos datos indican que los pri-miRNAs son estructuralmente análogos a los mRNAs.

Luego de la transcripción, el miRNA atraviesa la primera etapa de división; esta es iniciada por la Drosha RNAs III nuclear, una endonucleasa específica del RNA de doble cadena (dsRNA, por sus siglas en inglés) que introduce cortes escalonados en cada cadena de la hélice de RNA, y es responsable del procesamiento nuclear de los pri-miRNAs en precursores tallo-rizo (forma de pasador de cabello) de unos 70 nucleótidos llamados miRNA precursor (pre-miRNA, por sus siglas en inglés). Se ha demostrado que la interferencia RNA de Drosha resulta en una fuerte acumulación de pri-miRNA y la reducción de pre-miRNA y miRNA maduro in vivo. Los tallo-rizos RNA, con un rizo terminal grande no estructurado (sobre 10 nt), son los sustratos preferidos para la hendidura por Drosha. En el núcleo, Drosha funciona como un gran complejo en donde interactúa con la proteína DGCR8, un cofactor esencial para Drosha, el cual contiene 2 dominios ligadores de dsRNA. La Drosha humana recombinante sola muestra actividad RNasa no específica, pero la adición de DGCR8 la hace específica para el procesamiento de pri-miRNA. La estructura primaria y secundaria de los precursores miRNAs es conservada como rizos internos por lo que comúnmente aparecen bultos en posiciones específicas en el tallo miRNA; esto permite el correcto procesamiento futuro por las enzimas siguientes en la maduración del miRNA.

La exportación del pre-miRNA del núcleo al citoplasma es mediada por Exportina 5, que es un receptor de exportación nuclear para ciertas clases de dsRNA, incluyendo pre-miRNAs, RNAs de pasador virales y algunos tRNAs. Se ha demostrado que la exportación de pre-miRNAs es sensible al agotamiento de RanGTP nuclear (Ran es una proteína nuclear y GTP se refiere a guanosina-trifosfato), y por lo tanto mediada por ésta. Una vez en el citoplasma, hay un desensamble del complejo exportado por hidrólisis de GTP. Además del papel de Exportina 5 en la exportación nuclear de pre-miRNA, hay evidencia de que también tiene un papel en la prevención de la degradación nuclear de pre-miRNA.

La segunda etapa del procesamiento de miRNA está confinada al citoplasma. El pre-miRNA experimenta otra etapa de división, conducida por Dicer, que es una ribonucleasa multidominio que procesa al precursor pasador a un miRNA maduro dsRNA pequeño de unas 22 nt. Dicer funciona a través de dimerización intramolecular de sus 2 dominios RNasa III, asistida por los dominios ligadores de RNA que lo flanquean, los dominios PAZ y los dominios ligadores de dsRNA (dsRBD, por sus siglas en inglés) que generan productos con proyecciones de 2 nt en 3’. Los dominios PAZ son dominios altamente conservados de 130 aminoácidos que se unen a RNA, encontrados solamente en las proteínas Dicer y Argonauta. Luego de la hendidura (división) por Dicer en el pre-miRNA, el miRNA maduro es incorporado en un complejo de silenciado inducido por RNA (RISC, por sus siglas en inglés), cuyas funciones diversas pueden incluir la división de mRNA, supresión de la traducción, silenciado transcripcional y formación de heterocromatina. Este complejo funciona también en la interferencia de RNA. RISC es un complejo enzimático de múltiple acreción, lo que significa que el miRNA puede dirigir varias rondas de división dirigida (target cleavage) una vez incorporado. Una cadena del miRNA de doble cadena es preferiblemente incorporada en RISC, dependiendo de la termodinámica de la dupla.

Se ha aislado un complejo de proteína trimérico de unos 500 kDa que contiene Dicer, proteína ligadora de RNA transactivadora de respuesta al virus de inmunodeficiencia humana (TRBP, por sus siglas en inglés) y Argonauta2 (Ago2, por sus siglas en inglés) y se ha demostrado que este complejo es requerido para la biogénesis de miRNA. Existe evidencia de que el complejo se forma antes de la incorporación de miRNA. TRBP es una proteína con 3 dsRBDs que son esenciales para el procesamiento de miRNA. Ago2 es un miembro de la familia de proteínas Argonauta y el único miembro en humanos asociado con el silenciado de siRNA y miRNA; sirve como el motor catalítico de RISC por un dominio PIWI que contiene una estructura tipo RNasaH, por su actividad rebanadora endonucleolítica. Se ha encontrado que AGo2 es esencial para el desarrollo del ratón, y que las células que carecen de ella son incapaces de responder en experimentos con siRNAs. Adicionalmente, mutaciones dentro de su dominio RNasaH inactivan a RISC, probando su papel fundamental en el silenciado de mRNA inducido por miRNA.

El apareamiento entre miRNAs y sus mRNAs objetivo inhibe la traducción. Por lo tanto, los RISC conteniendo miRNA pueden interferir directamente con la iniciación o elongación de la traducción y tal vez apuntan al mRNA en centros de degradación. Estos centros, que contienen mRNAs sin traducir, son sitios de degradación de mRNA previamente observados en levadura y en células animales, y son llamados cuerpos de procesamiento (o cuerpos P).  En apoyo de esta noción está la evidencia de la presencia de proteína de la familia Argonauta en estos cuerpos P. aunque no está claro si como una causa o como una consecuencia de la inhibición de la síntesis de proteínas. Se ha demostrado que RCK/p54 es la molécula efectora en miRNA-RISC que reprime la traducción; RCK/p54, el homólogo humano de la Dhh1p de levadura, es una proteína del cuerpo P y un miembro de la familia de helicasa caja DEAE dependiente de ATP. En las células humanas, RCK/p54 interactúa en los cuerpos P con el factor de iniciación de traducción eIF4E. El resultado global de la unión de mRNAs en el complejo RISC por miRNAs apareados es la inhibición de la traducción de los mRNAs, y por lo tanto niveles disminuidos de proteína de los mRNAs objetivo de los miRNAs. Por lo tanto, los miRNAs juegan un papel clave en la regulación de la funcionalidad de los genes codificadores.

 

La miRómica, una nueva piedra angular

El análisis de la expresión de miRNA en todo el genoma proporciona información poderosa al estatus funcional del genoma codificador. Durante los últimos 5 años, hay habido una mejora marcada en las tecnologías de perfilado para la investigación del miRoma. Lo que inició en 2004 con laboriosos análisis de Northern Blot para tamizar 119 miRNAs, ha madurado hoy en día en múltiples plataformas tecnológicas que pueden tamizar con robustez más de mil miRNAs.

Una de las primeras versiones de microchip miR contenía oligonucleótidos correspondientes a 245 miRNAs de genomas humanos y de ratón. Contemporáneamente, RNAs de 18-26 nucleótidos fueron aislados de cerebros en desarrollo de rata y mono. De las secuencias de estos RNAs y las secuencias de los genomas de rata y humano, fueron seleccionados los RNAs pequeños con mayor posibilidad de ser derivados de precursores tallo-rizo típicos de los miRNAs. Utilizando este acercamiento, se desarrolló una tecnología de microarray adecuada para detectar 138 miRNAs mamíferos.

La naturaleza corta de las secuencias objetivo hace difícil alcanzar suficiente especificidad con tecnologías estándar de oligonucleótido de DNA. La síntesis directa de cDNA cebada aleatoriamente en RNAs pequeños sintetizados químicamente o en miRNAs maduros purificados en gel de células humanas puede producir sondas de cDNA de longitud completa, específicas y sensibles. Las sondas de cDNA etiquetadas internamente son sensibles para detectar expresión diferencial de miRNA entre los grupos control y de prueba. Aunque la meta del perfilado de miRNA continúa siendo el mismo, la tecnología ha mejorado marcadamente en el tiempo, permitiendo análisis más robustos.

Algunos miRNAs difieren entre sí por tan poco como un solo nucleótido, enfatizando la importancia de una buena discriminación de apareamiento incompleto o defectuoso. Para atender este tema, se utiliza un acercamiento basado en ácidos nucleicos asegurados (LNA, por sus siglas en inglés, y se refiere con frecuencia a RNA inaccesible). Los LNAs son una clase de análogos de nucleótido conformacionalmente restringidos. La incorporación de LNA en un oligonucleótido incrementa la afinidad de dicho oligonucleótido por su RNA complementario o su DNA objetivo, incrementando la temperatura de fusión (Tm, por sus siglas en inglés) de la dupla. Adicionalmente la diferencia en Tm entre un objetivo perfectamente apareado y un objetivo mal apareado es substancialmente más alta que la observada cuando se utiliza un oligonucleótido basado en DNA. Estas propiedades, la Tm elevada y la excelente discriminación del apareamiento incompleto, hacen de las sondas modificadas por LNA el instrumento ideal para análisis de objetivos cortos y similares como los miRNAs. Adicionalmente, ajustando el contenido de LNA y la longitud de la sonda, es posible diseñar sondas Tm-normalizadas, permitiendo condiciones de hibridación que son óptimas para todas las sondas empleadas en, por ejemplo, un array.

Recientemente se ha aplicado la secuenciación profunda para el perfilado de miRNA. La secuenciación profunda utiliza masivamente la secuenciación paralela, generando millones de lecturas de secuencia de RNA pequeño de una sola muestra. El perfilado de miRNAs por secuenciación profunda mide la abundancia absoluta y permite el descubrimiento de nuevos microRNAs que han eludido los esfuerzos previos de clonado y secuenciación estándar. Las bases de datos públicas proporcionan predicciones in silico de objetivos génicos de miRNA por varios algoritmos. Para determinar mejor cuales de estas predicciones representan positivos verdaderos, los datos de expresión de microRNA pueden ser integrados con datos de expresión génica para identificar pares funcionales putativos microRNA:mRNA. El análisis de perfilado de la expresión de miRNA puede realizarse también utilizando una plataforma de ensayo de bajo costo basada en PCR. Los cebadores (primers) asociados con estos ensayos de miRNA fueron diseñados utilizando un nuevo algoritmo bioinformático que ha incorporado muchas características de selección de cebador para especificidad, sensibilidad y homogeneidad del ensayo.

 

Nutrigenómica y miR

La conclusión exitosa del Proyecto del Genoma Humano y el surgimiento de las poderosas herramientas ómicas ha llevado a una nueva era de la medicina y la nutriología. La aplicación de las tecnologías ómicas para mejorar el entendimiento de las ciencias nutriológicas ha derivado en el desarrollo de la nutrigenómica, con la meta global de entender cómo la nutrición influencia las rutas metabólicas y el control homeostático, cómo esta regulación es alterada en la fase temprana de una enfermedad relacionada a la dieta y en qué grado los genotipos sensibilizantes individuales contribuyen a dichas enfermedades.

La relación nutrición-salud es altamente influenciada por la interacción nutrimento-gen. La respuesta funcional de los genes a los elementos nutricionales consumidos proporciona la base fundamental de la nutrigenómica. En humanos, el impresionado metabólico en la vida temprana ha sido evidente en varios estudios epidemiológicos. Tanto en el útero como durante los primeros años de vida, las unidades madre-hijo subalimentadas o sobrealimentadas imprimen cambios génicos que llevan a problemas metabólicos crónicos en la vida posterior.

Durante la última década, la nutrigenómica ha emergido como un motor clave de la comercialización de alimentos, y el rango de productos cubiertos ha sido amplio, expandiéndose de los alimentos funcionales a los nutrimentos individuales. El desarrollo de la biología de miRNA ha expuesto una importante grieta en la armadura de la nutrigenómica. Hasta la actualidad, el campo está limitado a los genes codificadores solamente, y en su forma actual la nutrigenómica no aprecia el significado lave de los genes no codificadores en la salud y en la enfermedad de los humanos. Los desarrollos actuales en la biología de los genes no codificadores, especialmente miRNA, proporciona una oportunidad extraordinaria para vigorizar a la nutrigenómica, incorporando la nutrimiRómica como un subcomponente clave.

La nutrimiRómica puede ayudar a entender la relación entre los elementos alimenticios y la respuesta del miRNA en compartimientos corporales específicos. Dicho conocimiento, junto con información de los genes codificadores responsivos a nutrimentos, ayudará a comprender la nutrigenómica como un todo. Por ejemplo, asumamos que un nutrimento induce un juego de genes codificadores llamados CG1-100. Digamos que el mismo nutrimento también induce un juego de genes no codificadores NG50-150 tales que NG50-100 son miRs que se dirigen específicamente a CG50-100. En ese caso, aunque el perfilado de expresión de los genes codificadores identificaría a CG1-100 como genes candidatos que son sensibles al nutrimento específico, CG50-100 podrían ser funcionalmente inertes como NG50-100 los silenciaría. Por tanto, cuando el perfilado de la expresión tanto de los genes codificadores como de los no codificadores es tomado en cuenta, CG1-50 emergería como el subjuego actual de genes codificadores sensibles a los nutrimentos dados que son funcionalmente activos. Este es un ejemplo supersimplificado para resaltar la idea general, y en seguida se proporciona un ejemplo más específico utilizando la obesidad como el caso en uso.

Ejemplo

De acuerdo a la Organización Mundial de la Salud, los Estados Unidos tienen el quinto lugar a nivel mundial de enfermedades relacionadas a la obesidad. Dos tercios de los estadounidenses tienen sobrepeso, con un índice de masa corporal (BMI, por sus siglas en inglés) mayor a 25. Los estadounidenses gastan cerca de $117 millardos de dólares en complicaciones relacionadas a la obesidad, con otros $33 millardos gastados anualmente en intentos para controlar o perder peso. Los suplementos nutricionales son considerados una contramedida potencialmente valiosa para combatir la obesidad; los estudios para identificar los genes codificadores sensibles a los suplementos nutricionales utilizando acercamientos de tamizado de todo el genoma, son poderosos para formular hipótesis que explicarían el mecanismo de acción del suplemento en cuestión.

La obesidad es el resultado de un desbalance entre la ingestión de alimento y el gasto de energía, resultando en el almacenamiento energético como grasa. Los estudios de perfilado de expresión basados en microarrays han proporcionado a los investigadores con varios nuevos genes candidato cuya expresión en el tejido adiposo es regulada por la obesidad. Integrando los perfiles de expresión con los análisis de ligamiento y/o asociación en todo el genoma, es una estrategia prometedora para identificar nuevos genes detrás de la susceptibilidad a la obesidad. Esta promesa solamente puede realizarse cuando la significancia del miRNA en el tejido adiposo es factorizada. Dado que los miRNAs tienen un papel importante en el estado funcional de los genes codificadores, es posible que la regulación a la alza de miRNAs que se dirigen a genes codificadores adipogénicos proporcione soluciones productivas dirigidas al manejo de la obesidad.

El apoyo de este concepto surge de la observación reciente de miRNAs inducidos durante la adipogénesis, que aceleran el desarrollo del adipocito y son regulados a la baja en la obesidad. La expresión ectópica de miR-103 o miR-143 en los preadipocitos acelera la adipogénesis, demostrando que os miRNA juegan un papel clave en la obesidad.

La angiogénesis es otro factor que alimenta el crecimiento de tejido adiposo. Los estudios recientes demuestran que la angiogénesis está bajo el estricto control de miRNAs. Los suplementos nutricionales dirigidos a manejar la obesidad deben ser investigados por su habilidad para regular favorablemente la respuesta de miRNA en el tejido adiposo, minimizando el almacenamiento y acelerando el catabolismo de la grasa celular y tisular.

En un hecho que la nutrimiRómica representa una poderosa herramienta en este sentido y que deberá surgir como un motor importante de la industria de suplementos nutricionales en el futuro cercano.