Introducción a los receptores nucleares

Pequeñas moléculas lipofílicas, tales como hormonas liposolubles, vitaminas y metabolismos intermedios, juegan un importante papel en el crecimiento, diferenciación, metabolismo, reproducción y morfogénesis de los organismos superiores, incluyendo los humanos. A diferencia de las hormonas polipéptidas que actúan en receptores unidos a la membrana y activan rutas de señalización que derivan en la regulación de genes, la mayoría de las acciones celulares de las hormonas lipofílicas son mediadas por medio de unión directa a receptores nucleares, que actúan como factores de transcripción inducibles por ligando, para activar o reprimir muchos genes objetivo.

La superfamilia de receptores nucleares

La superfamilia de receptores nucleares incluye a los receptores para las hormonas lipofílicas, para las formas activas de la vitamina A (los retinoides) y la vitamina D (1,25-dihidroxivitamina D3), así como receptores “huérfanos” sin ligandos conocidos. Que los receptores huérfanos juegan papeles clave en el desarrollo, la homeostasis y la enfermedad, ha sido probado por eliminación selectiva en ratones y por su asociación con diferentes enfermedades incluyendo ateroesclerosis, cáncer, diabetes o desórdenes de lípidos.

Algunos receptores huérfanos pueden tener un ligando aún no identificado, pero otros pueden actuar en una manera constitutiva o podrían ser activados por otros medios (por ejemplo, fosforilación). En años recientes, varios receptores huérfanos han sido “adoptados”. Algunos de los nuevos ligandos son productos del metabolismo lípido como ácidos grados, leucotrienos, derivados de prostaglandina y colesterol, ácidos biliares, pregnanos o aún derivados de benzoato.

Por lo tanto, a diferencia de las hormonas clásicas, otros ligandos se originan intracelularmente como productos metabólicos, lo que puede explicar el por qué su papel como reguladores de receptores nucleares no había sido previamente identificado por experimentación fisiológica. Adicionalmente, a diferencia de los receptores endócrinos clásicos que son activados por ligandos de alta afinidad con constantes de disociación en el rango nanomolar, estos “receptores metabólicos” son activados por ligandos abundantes pero de baja afinidad con constantes de disociación en el rango micromolar.

El análisis evolutivo de los receptores ha llevado a una subdivisión en 6 diferentes subfamilias. Una familia grande, la Clase I, está formada por receptores de la hormona tiroidea (TRs), receptores del ácido retinoico (RARs), receptores de la vitamina D (VDRs) y receptores activados por proliferador de peroxisoma (PPARs), así como diferentes receptores huérfanos. Algunos de estos receptores huérfanos han sido recientemente adoptados.

La segunda subfamilia, la Clase II, contiene los receptores de retinoide X (RXRs), junto con estimuladores corriente arriba de ovoalbúmina de pollo (COUPs), factor nuclear hepatocito 4 (HNF4), receptores en testículos (TR2) y receptores involucrados en el desarrollo del ojo (TLX y PNR). Los RXRs juegan un importante papel en la señalización de receptor nuclear, al ser socios de diferentes receptores que se unen como heterodímeros al DNA.

El ácido 9-cis-retinoico se une con alta afinidad a RXR y ha sido ampliamente utilizado para estudiar la señalización de RXR. El ácido docosahexaenoico (DHA) es un ácido graso que se une con afinidad baja pero podría ser un ligando endógeno para RXR. Ligandos para otros receptores no han sido todavía identificados.

La tercera subfamilia, la Clase III, está formada por los receptores esteroides y los altamente relacionados receptores huérfanos ERR (receptores relacionados a estrógeno).

Las subfamilias cuarta, quinta y sexta (Clase IV, Clase V y Clase VI, respectivamente) contienen a los receptores huérfanos NGFI-B, FTZ-1/SF-1 y GCNF, respectivamente.

La mayoría de las subfamilias parecen ser antiguas dado que tienen un homólogo artrópodo, con excepción de los receptores esteroides que no tienen homólogos conocidos. Un último grupo, conocido como Clase 0, incluye dos receptores, SHP y DAX-1, cuyos ligandos y elemento de respuesta se desconocen.

Mecanismo de acción

Algunos receptores esteroides, como el receptor glucocorticoide (GR), son secuestrados en el citoplasma por asociación con un gran complejo multiproteínico de chaperones, incluyendo Hsp90 y Hsp56. La unión al ligando induce la disociación del complejo y la translocación nuclear. Datos recientes han demostrado la presencia de receptores no unidos por otras hormonas esteroides en el núcleo, con equilibrio entre ambos compartimientos celulares. Muchos receptores no esteroides sin ligar están localizados en el núcleo y pueden interactuar directamente con la cromatina. Una vez en el núcleo, los receptores regulan la transcripción por unión, generalmente, como dímeros, a secuencias de DNA llamadas elementos de respuesta hormonal (HREs) positiva o negativa, normalmente localizados en regiones reguladoras de genes objetivo (conocidos también como blanco, diana o target).

Los efectos de los receptores nucleares en la transcripción están mediados por reclutamiento de co-reguladores. Un subjuego de receptores se une a co-represores y activamente reprimen la expresión del gen objetivo en la ausencia de ligando. Con la unión del ligando, los receptores realizan un cambio conformacional que causa la liberación del co-represor y el reclutamiento de complejos de co-activador y la activación transcripcional de los genes conteniendo HREs. Los receptores nucleares pueden también regular la expresión de los genes que no contienen HREs por modulación de la actividad de las rutas de señalización y factores de transcripción que se unen al promotor objetivo.

Existen rutas alternativas independientes de ligando para la activación de receptores nucleares. Por ejemplo, algunos receptores pueden ser activados por fosforilación medida por hormonas y factores de crecimiento que estimulan diversas rutas de transducción de señal. Estas rutas de señalización pueden afectar también transcripción mediada por hormonas, por modificación de co-activadores y co-represores. Los receptores y co-reguladores son también blanco de otras modificaciones tales como metilación, acetilación, ubiquitinación, sumoilación, etc., que pueden regular su actividad, niveles y localización.

Finalmente, los ligandos de receptores nucleares pueden también efectuar respuestas rápidas también llamadas respuestas “no genómicas” o “no genotrópicas”, que no son bloqueadas por inhibidores de transcripción o traducción. Estas acciones rápidas podrían estar mediadas por una fracción de receptores nucleares asociados a membrana, o por ocupación de un receptor de membrana putativo acoplado por sistemas apropiados de segundo mensajero a la generación de una respuesta biológica.

Por medio de estos mecanismos “no genómicos” las hormonas esteroides pueden incrementar el calcio intracelular o activar las quinasas de proteína activadas por mitógeno (MAPKs) o la fosfoinositol-3-quinasa (PI3K) para provocar efectos celulares.

El ligando puede ser generados en 3 formas diferentes: 1) un ligando activo u hormona puede ser sintetizado en un órgano endócrino clásico, 2) el ligando puede ser generado a partir de un precursor o pro-hormona dentro de la célula objetivo, y 3) el ligando puede ser un metabolito celular endógeno.

 

Estructura de los receptores nucleares

Los receptores nucleares presentan una estructura modular con diferentes regiones que corresponden a dominios funcionales autónomos que pueden ser intercambiados entre receptores relacionados sin pérdida de función. Un receptor nuclear típico consiste de una región N-terminal variable (A/B), un dominio conservado de unión a DNA (DBD) o región C, una región ligadora D, y una región conservada E que contiene el dominio de unión a ligando (LBD).

Algunos receptores poseen también una región C-terminal (F) de función desconocida.

Los receptores también tienen regiones requeridas para la activación transcripcional: una función de activación transcripcional independiente de ligando (AF-1) localizada en la región hipervariable A/F, y un dominio de activación transcripcional conservada dependiente de ligando, llamado AF-2, localizado en la C-terminal de la LBD.

La región A/B

Esta región moduladora es la más variable tanto en tamaño como en secuencia, y en muchos casos contiene un dominio AF-1. Múltiples isoformas de receptor generadas por un solo gen por empalme alternativo o por el uso de promotores alternativos, divergen en sus regiones A/B en la mayoría de los casos.

Por otro lado, el dominio modulador es el objetivo de fosforilación mediada por diferentes rutas de señalización y ésta modificación puede afectar significativamente la actividad transcripcional.

 

El dominio de unión de DNA

Este es el dominio más conservado de los receptores nucleares, y confiere la habilidad para reconocer secuencias objetivo de DNA específicas. El DBD contiene 9 cisteínas, así como otros residuos que son conservados a través de la superfamilia de receptores nucleares y que son requeridos para la unión de alta afinidad al DNA.

Este dominio comprende dos “dedos de cinc” que se expanden aproximadamente 60-70 aminoácidos y una extensión C-terminal (CTE), la cual contiene las llamadas cajas T y A. En cada dedo de cinc, 4 de las cisteínas invariables coordinan tetraédricamente  un ión de cinc. Los aminoácidos requeridos para la discriminación de los motivos de reconocimiento de DNA central (core) están presentes en la base del primer dedo en una región llamada caja P y otros residuos del segundo dedo de cinc que forman la llamada caja D están involucrados en la dimerización.

Estudios estructurales han mostrado que el DBD base está compuesto de dos α-hélices. La primera, la hélice de reconocimiento, que comienza en el tercer residuo conservado de cisteína y une el surco mayor del DNA, contiene la caja P y hace contactos con bases específicas de DNA. La segunda hélice contiene la caja D y forma un ángulo recto con la hélice de reconocimiento.

 

La región bisagra

El dominio D no está bien conservado entre los diferentes receptores y sirve como una bisagra entre el DBD y el LBD, permitiendo la rotación del DBD. El dominio D en muchos casos alberga las señales de localización nuclear y también contiene residuos cuya mutación abole la interacción con los co-represores de receptores nucleares. Adicionalmente, esta región se asocia fuertemente con LBD pero solamente en presencia de ligando o co-represores, ejerciendo un efecto estabilizador en la estructura global del receptor.

 

El dominio de unión a ligando

El LBD es un dominio multifuncional que, además de unirse al ligando, media la homodimerización y la heterodimerización, la interacción con las proteínas de choque térmico (heat-shock proteins), la actividad transcripcional dependiente de ligando y, en algunos casos, la represión transcripcional reversible de hormonas.

Los LBDs contienen 2 regiones bien conservadas: un “motivo firma” o Ti y el motivo C-terminal AF-2 responsable de la activación transcripcional dependiente de ligando.

Aunque una estructura tridimensional de un receptor nuclear completo no ha sido todavía obtenida, se han resuelto las estructuras cristalinas de los LBDs de múltiples receptores nucleares. Los LBDs están generalmente formados por 12 regiones conservadas de α-hélice numeradas H1 a H12.

El bolsillo de unión a ligando, que acomoda el ligando, está principalmente hecho de aminoácidos no polares y está enterrado dentro de la mitad inferior del LBD. El tamaño del bolsillo de unión a ligando varía entre los diferentes receptores, siendo pequeño en los receptores clásicos que se unen al ligando con alta afinidad y muy grandes en los receptores “metabólicos” que pueden unirse a ligandos de diferentes tamaños con afinidad baja.

En contraste, el bolsillo de unión a ligando del receptor huérfano NURR está lleno con voluminosas cadenas laterales hidrofóbicas, sugiriendo que podría ser un receptor huérfano verdadero.

 

 

El dominio AF-2

El dominio AF-2, contenido en H12, es requerido para la transactivación dependiente de ligando. Este dominio posee una homología alta en una región muy corta que adopta una conformación de α-hélice anfipática, con un motivo de consenso φφXEφφ (siendo φ un aminoácido hidrofóbico).

Aunque el H12 del LBD contiene la actividad AF-2 central, este dominio comprende otros elementos dispersos que se reúnen con la unión al ligando. Uno de dichos elementos es el “motivo firma”, comprendiendo la mitad C-terminal de la hélice 3 y la hélice 4. Mutaciones en esta región no afectan la unión a ligando ni la dimerización, pero deterioran la transactivación dependiente de ligando. Específicamente, una lisina altamente conservada en el C-término de la hélice 3 es importante para la actividad transcripcional de varios receptores.

 

Unión de monómeros, homodímeros y heterodímeros a los elementos de respuesta a hormona

Los receptores nucleares regulan la transcripción por unión a secuencias específicas de DNA en regiones reguladoras de genes objetivo, conocidas como elementos de respuesta a hormona o HREs. Los receptores de hormonas esteroides típicamente se unen como homodímeros a palíndromos de la secuencia AGAACA espaciados por 3 nucleótidos, con la excepción de los ERs que poseen una caja P diferente y reconocen un motivo de consenso AGG/TTCA con la misma configuración.

Dos monómeros de receptor de hormona esteroide se unen cooperativamente a sus elementos de respuesta, y las interfaces de dimerización han sido identificadas tanto en LBD como en DBD. La interfaz de dimerización en DBD involucra la caja D que contacta la misma caja del receptor socio. La dimerización en LBD está mediada por una secuencia hidrofóbica en H10 que forma una estructura en espiral, o por formación de una β-hoja en el caso del receptor glucocorticoide.

En contraste con los receptores esteroides que casi exclusivamente reconocen elementos palidrómicos, los receptores no esteroideos se pueden unir como homodímeros o heterodímeros a HREs compuestos de 2 copias del motivo AGG/TTCA configurados como palíndromos (Pal), palíndromos invertidos (IPs) o repeticiones directas (DRs). De hecho, los HREs más potentes para los receptores no esteroides parecen estar configurados como DRs en los cuales la longitud de la región espaciadora es una importante determinante de la especificidad de las respuestas hormonales. Así, las DRs separadas por 3, 4 y 5 pares base (DR3, DR4 y DR5) son HREs para VDR, TR y RAR, respectivamente.

Un DR1 sirve como HRE preferido para RXR o PPAR, y RAR puede también activar la transcripción por DR2.

En el caso de los heterodímeros, el receptor de retinoide X RXR es el socio promiscuo de diferentes receptores. Aunque los típicos receptores heterodiméricos pueden unirse a sus elementos de respuesta como homodímeros, la heterodimerización con RXR incrementa fuertemente la afinidad por DNA y la actividad transcripcional. Por lo tanto, RXR juega un papel dual en la señalización de receptores nucleares. Por un lado, este receptor se una a un DR1 como homodímero y activa la transcripción en respuesta a ácido 9-cis-retinoico, y por otro lado sirve como un socio heterodímero para otros receptores nucleares.

Dado que los DRs son inherentemente asimétricos, los complejos heterodiméricos pueden unirse a ellos con 2 distintas polaridades. Se ha establecido que en DR3, DR4 y DR5, RXR ocupa la mitad corriente arriba (upstream o hacia el extremo 5’) y el socio heterodimérico (por ejemplo CRD, TR o RAR) ocupa el motivo corriente abajo (downstream o hacia el extremo 3’). En contraste, los heterodímeros RAR/RXR se unen con una polaridad invertida (con RXR ocupando la mitad hacia el extremo 3’) en los elementos DR1, cambiando la actividad del heterodímero de un activador a un represor de los genes que responden al ácido retinoico.

La habilidad de los receptores heterodiméricos para unirse a palíndromos, palíndromos invertidos y elementos DR implica que DBD debe ser rotacionalmente flexible con respecto a la interfaz de dimerización LBD y en un DR los receptores deben usar una región diferente de DBD de cada receptor para crear la interfaz de dimerización.

Varios receptores nucleares huérfanos se pueden unir a DNA con alta afinidad como monómeros. Para los HREs monoméricos, una sola mitad AGG/TTCA está precedida por una secuencia rica en A/T en el flanco 5’. En este caso, la CTE del DBD puede hacer contactos extensos con el surco menor del DNA y efectivamente extiende el contacto superficial del DBD receptor más allá de la secuencia de reconocimiento de la mitad de consenso, proporcionando contactos receptor-DNA adicionales en los sitios monoméricos necesarios para una unión específica u de alta afinidad.

La existencia de 2 tipos de heterodímeros de receptores nucleares, no-permisivos y permisivos, se ha descrito. Los heterodímeros permisivos, como PPAR/RXR, FXR7RXR, LXR/RXR o NGFI-B/RXR, pueden ser activados indistintamente por ligandos de RXR o de su receptor socio, y son sinérgicamente activados en presencia de ambos ligandos. Sin embargo, en los heterodímeros no permisivos las actividades transcripcionales inducidas por ligando de RXR son suprimidas, por lo que se piensa que la formación del heterodímero imposibilita la unión del ligando a RXR; así, en estos complejos se dice que RXR es un “socio silencioso”.

Los TRs así como los receptores para vitamina D (VDRs) o para el ácido retinoico (RARs) han sido considerados como no permisivos. Sin embargo, datos recientes indican que RXR puede unir el ligando y reclutar co-activadores como un heterodímero con RAR o TR.

La carencia de transcripción autónoma en la unión del agonista RXR podría deberse al hecho de que en el ambiente celular normal los co-represores no se disocian de los receptores y prohíben el acceso de co-activador debido a que la unión de co-regulador es mutuamente exclusiva. Este modelo predice que la transcripción por agonistas RXR (retinoides) podría ser obtenida bajo algunas condiciones, como en las células expresando altos niveles de co-activador.

 

Activación dependiente de ligando y co-activadores de receptor nuclear

La formación del complejo de iniciación transcripcional en los promotores dependientes de RNA-polimerasa II requiere la unión de los factores de transcripción generales (GTFs). Los complejos preformados, compuestos de RNA-polimerasa II, GTFs, SRBs (supresor de RNA-polimerasa B) y varios otras proteínas, llamados “holoenzima”, pueden ser directamente reclutados al promotor por factores de transcripción específicos para una secuencia.

La hipótesis actual es que los factores de transcripción finalmente causarán su efecto en la expresión del gen al influenciar la tasa de ensamble de estos complejos al promotor regulado.

Un aspecto de los mecanismos por los cuales los receptores nucleares afectan la tasa de transcripción dirigida por RNA-polimerasa II involucra muy posiblemente la interacción de los receptores con componentes del complejo de preiniciación de la transcripción. Así, diferentes receptores nucleares son capaces de interactuar directamente con GTFs incluyendo TBP (proteína ligadora a caja TATA), ciertos TAFs (factores asociados a TBP), TFIIB o TFIIH. Sin embargo, la modulación del ensamble de complejos de preiniciación en el promotor objetivo por los activadores transcripcionales involucra no solamente acciones directas en los componentes de la maquinaria transcripcional basal, sino también acciones indirectas mediadas por el reclutamiento de co-reguladores (co-activadores y co-represores).

Los co-activadores, también llamados factores intermediarios de transcripción, son moléculas puente que median las interacciones de los factores de transcripción con la maquinaria transcripcional basal. El paquete de DNA en los nucleosomas provee un impedimento importante a la transcripción. Dos mecanismos importantes alivian el bloqueo de transcripción causado por la estructura nucleosomal: las histonas pueden ser modificadas post-traduccionalmente para desestabilizar la cromatina, y los nucleosomas pueden ser interrumpidos mediante la actividad de las maquinas dependientes de ATP. No sorprende que algunos co-activadores de receptor sean factores remodeladores de cromatina dependientes de ATP o que posean actividad acetilasa, metilasa o ubiquitin-ligasa, mientras que otros pueden interactuar directamente con la maquinaria transcripcional basal y ayudar a reclutar la holoenzima RNA-polimerasa II.

El reclutamiento de los complejos de co-activador al promotor objetivo causa la descompactación de la cromatina y la activación transcripcional. Por el contrario, los co-represores pueden unirse a los activadores transcripcionales e inhibir la formación de complejos transcripcionalmente activos. Los co-represores son encontrados dentro de complejos multicomponente, los cuales pueden contener actividad histona-deacetilasa.

 

Histona-acetiltransferasas

Las histonas están sujetas a una gran variedad de modificaciones post-traducción, incluyendo acetilación, metilación, fosforilación, ubiquitinación, sumoilación y ADP-ribosilación. Estas modificaciones normalmente ocurren en los dominios de histona “cola” N-terminal y C-terminal, los cuales juegan un papel esencial en el control de dobleces de matrices nucleosomales en estructuras de orden superior.

Las modificaciones de histona pueden causar desdoblamiento de nucleosoma e incrementar el acceso del factor de transcripción al promotor. Por otro lado, las modificaciones podrían crear nuevas superficies de reconocimiento, promoviendo así la asociación de posibles reguladores. En efecto, los bromodominios pueden reconocer lisinas acetiladas y cromodominios unidos a lisinas metiladas. Esto ha llevado a la hipótesis del “código histona”, en la cual juegos combinatorios específicos de señales de modificación de histona pueden dictar la activación o represión transcripcional.

Una familia bien conocida de co-activadores que son reclutados a los receptores nucleares en una manera dependiente de ligando es la familia SRC/p160 (co-activador de receptor esteroide) con 3 miembros relacionados: SRC-1/NCoA-1, SRC/2TIF-2/GRIP-1/NCoA2, y p/CIP/ACTR/AIB1/TRAM1/RAC3. Estas proteínas actúan como co-activadores primarios, interactuando con diferentes receptores nucleares incluyendo receptores clásicos, metabólicos y huérfanos en una manera agonista y dependiente de AF-2. Ellas también sirven como plataformas para el reclutamiento de co-activadores secundarios.

Los 3 miembros de la familia de co-activadores p160 muestran una estructura conservada, con un dominio nuclear de interacción con receptor (RID) en su región central. La conservación es máxima en sus dominios N-terminal, el cual contiene la señal de localización nuclear y los dominios bHLH (hélice-rizo-hélice básico) y PAS (homología periodo/receptor hidrocarburo aril/único). Estos dominios median las interacciones con varios activadores transcripcionales, como BAF57 y el co-activador en espiral (CoCoA) de actividad desconocida.

Dos dominios de activación con actividad transcripcional intrínseca están también bien conservados en los co-activadores p160. El dominio de transactivación más fuerte (AD1) es la región de interacción con las histona-acetiltransferasa (HAT) CBP/p300, que sirve en papeles de co-activador para muchos diferentes tipos de factores de transcripción, actuando como co-integrador de rutas de señalización extracelulares e intracelulares.

La interacción de CBP con los receptores nucleares es también dependiente de ligando y de AF-2, y CBP/p300 parece funcionar como un co-activador esencial para estos receptores. Un dominio de transactivación más débil (AD2) localizado en el C-término más lejano de los co-activadores p160 se conoce por interactuar con co-activadores secundarios con actividad histona-arginina-metiltransferasa, como CARM1 y PRMT.

El RID de los co-activadores p160 contiene 3 motivos LxxLL altamente conservados, en donde L es leucina y x es cualquier aminoácido, necesarios y suficientes para mediar la asociación de los co-activadores a los receptores unidos a ligando. Los motivos LxxLL forman α-hélices anfipáticas con las leucinas, formando una superficie hidrofóbica en una cara de la hélice.

La estructura co-cristal de la LBD de varios receptores y un fragmento p160 conteniendo 2 motivos LxxLL indica que el ácido glutámico conservado en H12 y la lisina en H3 del receptor crean uniones hidrógeno a las leucinas 1 y 5 del RID co-activador. Estos contactos forman una abrazadera de carga que orienta y posiciona el RID co-activador en el surco hidrofóbico formado en LBD después del cambio conformacional creado por la unión al ligando.

Dos motivos LxxLL de una sola molécula de co-activador interactúan con los dominios AF-2 de ambos socios dímero y cada miembro del homodímero y heterodímero pueden cooperativamente reclutar una molécula de co-activador.

Se ha demostrado que los co-activadores p160 también interactúan con el dominio AF-1 de varios receptores nucleares. La unión de co-activadores al dominio AF-1 no involucra motivos LxxLL, sino más bien una región rica en glutamina del co-activador.

La asociación CBP/p300 a la región C-terminal de los co-activadores p160 parece ser primariamente responsable del reclutamiento de los receptores, pero hay también una interacción directa entre CBP y los receptores alrededor del N-término de CBP que contiene un motivo tipo LxxLL. Como diferentes regiones de CBP están involucradas en la interacción con receptores y co-activadores p160, ellas pueden formar un complejo ternario funcional.

Un dominio exhibiendo actividad HAT intrínseca está presente en CBP/p300 y la remoción o mutación del dominio resulta en una pérdida de función para muchos factores de transcripción, indicando la importancia de esta actividad. Los co-activadores p160 también poseen actividad HAT hacia la región C-terminal y pueden acetilar tanto histonas libres como histonas nucleosomales in vitro.

Los co-activadores p160 también se asocian con PCAF, el cual es un ortólogo de GCN5 de levadura y el primer HAT mamífero identificado. PCAF (factor de unión a CREB asociado a proteína) interactúa adicionalmente  de forma directa e independiente con los receptores y CBP/p300 en diferentes regiones y actúa como co-activador de receptor nuclear. Así, los co-activadores p160 podrían servir como una plataforma para puentear complejos de proteína con actividad HAT a receptores nucleares unidos a DNA.

Uno de los complejos multiproteínico grande y purificado que interactúa con receptores nucleares ligados contiene PCAF, la proteína interactuante con c-Myc TRRAP, y TAFII30, los cuales son factores comunes compartidos con el complejo TFTC (complejos co-activadores libres de TBP TAFII-HAT). Tres motivos LxxLL en la proteína TRRAP son responsables de las interacciones directas y dependientes de ligando con los receptores. Por lo tanto, los complejos HAT tipo TFTC también parecen actuar como una nueva clase de co-activadores para la función de receptor nuclear. Esto sugiere que el ensamble de complejos transcripcionales modulares grandes con actividad HAT está involucrado en la regulación transcripcional por receptores nucleares activados.

Ha sido demostrado que los niveles de acetilación de histona in vivo de los genes objetivo de receptor nuclear son fuertemente inducidos por tratamiento con el ligando correspondiente. La hiperacetilación es solamente disparada por agonistas y es dependiente de AF-2, confirmando que la acetilación de histona es una etapa crítica en la señalización hormonal mediada por receptor nuclear. Inesperadamente, la hiperacetilación de histona inducida por hormona en el promotor objetivo es transitoria y cíclica; el mecanismo subyacente para esta observación parece ser que los co-activadores p160 pueden ser acetilados por CBP/p300 y que la acetilación neutraliza las cargas positivas de los residuos de lisina adyacentes al motivo LxxLL central, e interrumpe la asociación de los complejos de co-activador HAT con los receptores unidos a promotor.

 

Proteína-arginina-metiltransferasas (PRMTs)

La metilación de histonas por PRMTs ha sido recientemente ligada a la activación de gen. PRMT1 y CARM1 (arginina-metiltransferasa 1 asociada a cofactor, también conocida como PRMT4) se unen a la región AD2 de los co-activadores p160 y actúan como co-activadores secundarios en la expresión genética regulada por receptor de hormona nuclear. Su potencial co-activador es dependiente de un dominio histona-metiltransferasa (HMT) intacto, y las actividades HMT, la de unión a p160 y la de homo-oligomerización residen en la región central. Mientras que la región N-terminal no tiene actividad conocida, la parte C-terminal de CARM1 contiene un dominio de activación autónomo, sugiriendo que interactúa con otras proteínas que ayudan a mediar la función co-activador CARM1.

Estudios recientes han demostrado la existencia de un interjuego entre acetilación de lisina y metilación de arginina. Al seguir el patrón de modificaciones dependiente de ligando in vivo en la histona H3 en el promotor objetivo, se ha mostrado que la metilación de arginina sigue a la acetilación previa de H3. Un mecanismo para la cooperación observada entre la acetilación y la metilación de arginina proviene del hallazgo de que la acetilación amarra CARM1 a la cola H3 y le permite actuar como una metiltransferasa más eficiente.

Adicionalmente, la acetilación de la histona H4 inhibe la metilación por PRMT1, mientras que la metilación de arginina 3 de H4 facilita su subsecuente acetilación por CBP/p300.

Además de las histonas, otras proteínas de cromatina son metiladas por PRMTs. Así, la metilación CARM1 de CBP/p300 también ha sido reportada como contribuidor a la activación transcripcional mediada por receptor. En contraste, esta metilación inhibe la unión del factor de transcripción CREB, causando la pérdida de transcripción dependiente de CREB.

 

Ubiquitinación y sumoilación

La degradación de receptores nucleares dependiente de ligando ocurre vía el proteasoma 26S, que degrada proteínas objetivo poli-ubiquitinadas. Este proceso involucra la ubiquitinación de los receptores y el reclutamiento del proteasoma en el dominio AF-2 a través de SUG-1, un componente del proteasoma.

Notablemente, el bloqueo del proteasoma abroga no solamente la degradación del receptor sino también la transactivación dependiente de ligando por diferentes receptores. El mecanismo paradójico para este fenómeno se desconoce, pero varias proteínas involucradas en proteólisis, tales como ubiquitin-ligasas y componentes del proteasoma, han sido propuestos como co-reguladores y son reclutados in vivo a los promotores regulados por receptor.

El papel dual de la maquinaria ubiquitin-proteasoma puede jugar un papel en el ensamblado/desensamblado de los receptores al promotor de genes objetivo, lo cual ha sido demostrado que ocurre en una manera cíclica. Adicionalmente, ambos complejos co-activador y co-represor pueden reclutar complejos de ubiquitinación y algunos de ellos han mostrado ser objetivos del proteasoma. Se ha demostrado también que las histonas son ubiquitinadas y que esta modificación regula la metilación de la histona H3, ligando el proteasoma a la regulación epigenética.

El modificador pequeño relacionado a ubiquitina (SUMO) también modifica un número de receptores nucleares y co-reguladores con diferentes resultados transcripcionales. La enzima SUMO-conjugadora, Ucb9, interactúa con el receptor glucocorticoide (GR), mejorando su actividad transcripcional, y ésta proteína así como SUMO E3-ligasas interactúan con el receptor de andrógeno (AR) reprimiendo su actividad.

La sumoilación parece no estar dirigida a las proteínas para degradación, y está más involucrada en la estabilización y localización subcelular de la proteína. Por ejemplo, la sumoilación de las proteínas p160 puede incrementar la interacción con el receptor y prolongar la retención en el núcleo.

 

Complejos remodeladores de cromatina dependientes de ATP

Los factores remodeladores dependientes de ATP, tales como SW12/SNF2, ISWI/SNFL2 o WINAC utilizan la energía derivada de la hidrólisis de ATP para catalizar la movilización de nucleosoma, la cual es un cambio neto en la posición del octámero de histona relativo al DNA. Se cree que este cambio facilita el acceso y función de componentes clave del aparato transcripcional.

Los complejos remodeladores de cromatina comprenden una subunidad ATPasa (BRG-1 o hBrahma) con un motivo ligador a nucleótido conservado junto con otros polipéptidos como BAFs (factor asociado a BRG-1).

Se sabe que los receptores se pueden unir a sus elementos de respuesta empacados en la cromatina y que la unión de receptor al DNA facilita la unión de otros factores cuyos sitios de unión no estaban previamente expuestos en los nucleosomas en una manera dependiente de ATP.

Diferentes receptores pueden interactuar con el complejo SWI/SNF, que es reclutado a los promotores objetivo en una manera dependiente de ligando. Los receptores no interactúan directamente con BRG-1 o hBrahma, sino diferentes receptores interactúan con diferentes subunidades BAF. Así, el receptor glucocorticoide (GR) interactúa con BAF250 y BAF60a, PPARγ interactúa con BAF60c, VDR/RXR interactúa con BAF60a y ERα interactúa con BAF57. Es interesante que esta proteína también haga contacto con los co-activadores p160, uniendo SWI/SNF con complejos HAT.

Los complejos SWI/SNF también parecen ser requeridos para la unión periódica y desplazamiento de receptores durante el remodelado de cromatina. La unión transitoria de GR al promotor objetivo ocurre en concierto con el remodelado del nucleosoma, pues el proceso es completamente dependiente de la presencia de SWI/SNF y ATP. Durante el remodelado del nucleosoma, las histonas H2A y H2B experimentar una extensa reorganización. Cuando SWI/SNF deja al promotor, GR es liberado y la cromatina está entonces lista para el siguiente ciclo de acción SWI/SNF dirigido por GR.

 

Complejos TRAP/DRIP/Mediador

Los complejos multiproteínicos denominados TRAP y DRIP que interactúan con TR o VDR (y otros receptores) en una manera dependiente de ligando y mejoran la actividad transcripcional dependiente de ligando han sido aislados. Ambos complejos son equivalentes al complejo mediador de levadura que junto con las proteínas SRB se asocia con la subunidad grande de RNA-polimerasa.

Se cree que el complejo TRAP/DRIP actúa al reclutar la polimerasa al promotor objetivo. Los complejos TRAP/DRIP son reclutados a la región central del receptor AF-2 en respuesta a la unión de ligando por medio de una subunidad única (DRIP205/TRAP220) vía un motivo LxxLL idéntico al encontrado en los co-activadores p160. Esta subunidad ancla las otras proteínas que forman el complejo TRAP/DRIP, el cual es presumiblemente preformado en la célula.

La actividad transcripcional dependiente de ligando de los receptores nucleares requiere el reclutamiento tanto del complejo TRAP/DRIP como de complejos co-activadores conteniendo histona-acetiltransferasa y metiltransferasa. Como el receptor unido a subunidades de ambos complejos co-activadores funcionalmente distintos, interactúa con la misma región del receptor, estos compiten entre sí para unirse con el receptor, pudiendo actuar independientemente o en forma consecutiva.

Los estudios, empleando primariamente ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), han mostrado que los complejos p160 y TRAP/DRIP son reclutados a promotores regulados por hormonas en una manera secuencial con cinéticas distintas. Los complejos p160 actúan antes que los TRAP/DRIP y este reclutamiento ordenado puede proceder por ciclos múltiples de asociación y disociación de factor, con múltiples rondas de transcripción ocurriendo dentro de cada ciclo.

Adicionalmente, existe evidencia para un modelo re “reclutamiento facilitado” en el cual las acciones previas de los complejos p160 facilitan el reclutamiento y acciones de TRAP/DRIP. La observación de que la acetilación de las proteínas p160 por CBP/p300 interrumpe la asociación con los receptores podría proporcionar la oportunidad a los complejos TRAP/DRIP para asociarse con el receptor.

 

En resumen, la unión de un ligando a los receptores nucleares permite el reclutamiento de co-activadores con actividades bioquímicas únicas en tiempos apropiados durante el proceso de transcripción. Los receptores pueden reclutar primero co-activadores con actividad HAT y HMT resultando en la acetilación y metilación de histona. Los complejos p160 entonces se disocian, luego de su acetilación o de su degradación por el proteasoma. Los complejos remodeladores dependientes de ATP pueden entonces ser reclutados causando el desplazamiento de los nucleosomas. Sin embargo, no puede excluirse que los complejos remodeladores podrían ser reclutados antes de los co-activadores p160 en un contexto de cromatina altamente condensada. Una vez que la cromatina ha sido descondensada, los receptores, vía su asociación con el complejo TRAP/DRIP, podrían ser capaces de reclutar la maquinaria transcripcional resultando en la estimulación de la expresión del gen.

 

Represión independiente de ligando y co-represores de receptor nuclear

Además de la activación de gen dependiente de ligando, receptores seleccionados incluyendo TR y RAR reprimen la transcripción basal en la ausencia de ligando. La unión del ligando hormonal al receptor libera el silenciado transcripcional y lleva a la activación del gane. El modelo actual de regulación genética por estos receptores asume que los receptores sin ligando están unidos al HRE y que bajo estas condiciones están asociados con co-represores responsables de la actividad silenciadora. Los cambios conformacionales efectuados en los receptores por la unión al ligando causarían la disociación de los co-represores y el reclutamiento de complejos co-activadores responsables de la activación transcripcional.

Los co-represores mejor caracterizados que se asocian con TR y RAR son proteínas celulares de 270 KDa llamadas NCoR (co-represor nuclear) y SMRT (mediador silenciador para receptores retinoico y de hormona tiroidea). Los TRs y RARs sin ligando interactúan fuertemente con NCoR y SMRT y la adición del ligando induce la disociación de los co-represores.

NCoR y SMRT se relacionan tanto estructural como funcionalmente. Contienen 3 dominios represores (RD) autónomos y un dominio interactor con el receptor (RID) localizado hacia el C-término. El RID está compuesto de 2 motivos (o cajas CoRNR), con la secuencia de consenso Lxx I/H I xxx I/I, posiblemente para adoptar una conformación de α-hélice anfipática. Sin embargo, cuando se compara con el motivo LxxLL, el motivo CoRNR presenta una hélice extendida en N-terminal; esta extensión parece ser requerida para la unión efectiva al receptor sin ligando.

Aunque una caja receptora CoR, localizada en H1 de LBD dentro de la región bisagra es esencial para la interacción de los receptores con los co-represores, la caja CoRNR no interactúa directamente con residuos en esta región, sino que se amarra a un surco hidrofóbico en la superficies de las hélices 3 y 4 de LBD. Dado que esta superficie es similar a la involucrada en la interacción co-activador, la unión de co-activador y co-represor es mutuamente exclusiva.

La estructura de un complejo ternario conteniendo LBD de PPARα unido a un antagonista con un motivo co-represor SMRT ha sido recientemente elucidada; en esta estructura, el motivo CoRNR adopta una α-hélice de 3 vueltas que se une al surco co-activador, previniendo que la hélice AF-2 asuma la conformación activa.

La unión de ligando por sí misma no es suficiente para inducir la disociación de co-represores. Parece ser que la región AF-2 sirve como disparador para liberar los co-represores de los receptores. H12 es completamente inhibidor para la unión de co-represor a casi todos los receptores nucleares. Por ejemplo, RXR no se une a co-represores, pero la eliminación de esta región permite la interacción de co-represor y la represión in vivo. En el caso de TRs y RARs, la mutación o eliminación del dominio AF-2 incrementa las interacciones con co-represores y reduce la liberación de co-represores luego de la unión con el ligando, indicando otra vez que H12 es inhibidor.

Aunque los receptores agonistas de hormona esteroide con ligando no interactúan efectivamente con NCoR o SMRT, se han observado claras interacciones tanto in vivo como in vitro con antagonistas unidos a receptor. Es posible que el reposicionamiento de H12 por los antagonistas permita la unión de co-represor en el bolsillo hidrofóbico. Esto sugiere que los receptores esteroides ocupados por antagonistas pueden actuar como silenciadores transcripcionales por la unión de co-represores celulares.

La represión transcripcional por los receptores unidos a co-represor parece estar mediada por el reclutamiento de histona-deacetilasas (HDACs) a la región promotora. HDAC1 y HDAC2 se encuentran en las células en grandes complejos multiproteínicos asociadas con proteínas mSin3. Sin3 es una proteína multidominio grande que forma casi seguramente el andamio en el que descansa el resto de los componentes del complejo. Los complejos mSin3/HDAC son abundantes y estables, y podrían estar disponibles para unión y reclutamiento por los represores.

mSin3 se asocia con SMRT y NCoR por medio del dominio represor C-terminal (RDI). La interacción entre los receptores sin ligando y mSin3 es, por lo tanto, no de manera directa sino mediada por NCoR y SMRT cuya función podría ser unir los receptores a los complejos HDAC.

Se pensaba que los co-represores actuaban exclusivamente por medio de reclutamiento indirecto de HDAC1 y HDAC2 (deacetilasas clase I), vía la proteína adaptadora mSin3. Sin embargo, se ha demostrado que RD3 reprime la transcripción por interacción directa con las deacetilasas clase II (HDACs 4, 5 y 7). NCoR y SMRT endógenos se asocian por separado con las HDACs clase II en un complejo que no contiene mSin3A o HDAC1. Por lo tanto un único co-represor podría utilizar distintos dominios para formar complejos HDAC clase I en una manera dependiente de Sin3, y complejos HDAC clase II en una manera independiente de Sin3.

Adicionalmente, un nuevo complejo conteniendo SMRT ha sido aislado de células HeLa. Este complejo contiene HDAC3 y proteína transducina tipo beta (BL1), una proteína que interactúa con histona H3 y está asociada con la sordera sensorineural humana. In vivo, TBL1 es puenteada a HDAC3 mediante SMRT y puede potenciar la represión por los receptores.

Las observaciones anteriores sugieren que la compactación de la estructura de cromatina debida al reclutamiento de complejos de histona-deacetilasas por los co-.represores está involucrada en el silenciado transcripcional por los receptores no esteroides sin ligando o los receptores esteroides unidos a antagonista. La unión al agonista permitiría la liberación de co-represores y permitiría que los receptores reclutaran co-activadores y estimulen la transcripción.

 

Represión transcripcional dependiente de ligando

Elementos de respuesta negativa

Aunque la mayoría de la atención ha sido enfocada en la activación transcripcional por unión de receptores nucleares a HREs positivos, los receptores nucleares pueden también reprimir la expresión del gen en una manera dependiente de ligando. En algunos casos los efectos represores pueden deberse a inhibición pasiva, la cual puede ocurrir debido a competencia por sitios del DNA con otros transactivadores o a la formación de heterodímeros transcripcionalmente inactivos.

Sin embargo, hay también “HREs negativos” que se unen a los receptores y median la regulación negativa por el ligando. Aunque por e momento las propiedades de los HREs negativos no se entienden del todo, la localización del elemento podría jugar un papel dado que los HREs negativos están generalmente muy cerca de los sitios de iniciación de transcripción, y algunos están posicionados corriente abajo (downstream) de la caja TATA o aún tienen una localización inusual en la región 3’ sin traducir.

Por otro lado, hay evidencia de que los co-represores y la actividad deacetilasa podría también estar involucrados en la regulación negativa dependiente de ligando por los receptores nucleares. En contraste con los genes regulados positivamente, se sabe que los receptores de hormona tiroidea incrementan la actividad basal de los promotores regulados negativamente, además de que el ligando invierte esta estimulación. Se ha reportado que co-represores y HDACs paradójicamente mejoran más que suprimen la actividad basal.

 

Interferencias de los receptores nucleares con otras rutas de señalización

Los receptores nucleares pueden también modular la expresión del gen por mecanismos independientes de unión a un HRE. Así, pueden alterar la expresión de genes que no contienen un HRE por interferencia positiva o negativa con la actividad de otros factores de transcripción, mecanismo conocido como “interferencia transcripcional”.

Así, los receptores pueden regular negativamente promotores de gen objetivo que portan sitios que unen AP1, NFκB o CREB, sin unirse a estos elementos del DNA. Los mecanismos responsables no se han entendido del todo y pueden involucrar interacción directa proteína-a-proteína de los receptores con estos factores de transcripción, o con factores intermediarios que amarran los receptores al promotor regulado.

Los receptores pueden también regular la actividad de las rutas de señalización que llevan a la activación de estos factores por diferentes mecanismos. Se cree que muchos de los efectos anti-proliferadores y las acciones anti-inflamatorias de los ligandos de receptores nucleares podrían estar mediados por mecanismos de “interferencia”.

Se ha demostrado que la transrrepresión juega un importante papel in vivo en los ratones noqueados en los cuales los receptores glucocorticoide o de hormona tiroidea tipo silvestre han sido substituidos por mutantes que no pueden unirse al DNA. Adicionalmente ha sido posible generar ligandos sintéticos que disocian la transactivación de la transrrepresión. Estos ligandos tienen un gran potencial como herramientas farmacológicas en el tratamiento de una variedad de enfermedades incluyendo cáncer y enfermedades inflamatorias.

La interferencia entre los receptores nucleares y otras rutas señalizadoras no está restringida al antagonismo transcripcional descrito arriba. La fosforilación de receptores nucleares provee una importante liga entre las rutas de señalización. Dependiendo del receptor y del residuo involucrado, en algunos casos la fosforilación puede inhibir la activación dependiente de ligando por los receptores nucleares debido a una reducción en la unión de ligando o en la afinidad de unión a DNA, o mediante la promoción de la degradación del receptor. Sin embargo, en otros casos los receptores pueden ser activados en la ausencia de sus ligandos cognados por fosforilación mediante señales originadas en receptores de la membrana. En ciertas enfermedades como el cáncer de próstata o seno esta modificación puede contribuir a la progresión de la enfermedad y derivar en la resistencia a la terapia antagonista.

Los co-activadores y co-represores también pueden ser fosforilados por diferentes quinasas y hay evidencia creciente de que esta modificación altera su actividad. Así, la fosforilación de SMRT inhibe su interacción con los receptores y provoca la redistribución del co-represor del núcleo al citoplasma. En contraste, la fosforilación de diferentes co-activadores por una variedad de quinasas puede mejorar su actividad enzimática y su afinidad por los receptores, llevando a una respuesta transcripcional incrementada.