Azúcares bajos en energía producidos por bacterias acidolácticas

Manitol, sorbitol y eritritol son alcoholes de azúcar naturales. El manitol es producido por bacterias, levaduras, hongos, algas y algunas plantas. Este poliol podría ayudar a dichos organismos a enfrentar diferentes estreses ambientales como el osmótico o el oxidante. El sorbitol es producido por una variedad de plantas y microorganismos. La producción de eritritol está usualmente asociada con levaduras pero también ha sido reportado para algunas bacterias acidolácticas (LAB, por sus siglas en inglés). Todos estos polioles presentan propiedades que son benéficas para la salud humana pues son edulcorantes no metabolizables, independientes de insulina, identificados como azúcares bajos en energía (o en calorías), lo que los hace aplicables en productos alimenticios para dietas especiales.

Adicionalmente, el manitol es utilizado en la industria farmacéutica como un poderoso agente osmótico diurético y como un agente osmótico para disminuir el edema cerebral y celular. La biosíntesis de manitol por fermentación bacteriana se ha convertido en una alternativa interesante para la producción química. La síntesis química utilizando hidrogenación de níquel asistida con catalizador muestra varias desventajas económicas, tales como elevados costos de producción y baja recuperación de producto. Adicionalmente, la capacidad de ciertas LAB pertenecientes a especies homofermentadoras y heterofermentadoras, para sintetizar manitol ofrece la posibilidad de producción in situ en alimentos.

Por esta razón, se han reportado diferentes estrategias basadas en tecnología de fermentación para mejorar la producción de manitol por LAB. Actualmente se alcanzan rendimientos de manitol entre el 93 % y el 97 %, utilizando un bioproceso con una cepa de LAB heterofermentadora. Más aún, ya se reporta la ingeniería metabólica de mutantes deficientes en lactato deshidrogenasa grado alimenticio, en particular para la producción de sorbitol por LAB.

 

Clasificación y ocurrencia natural

Los alcoholes de azúcar son alcoholes polihídricos (polioles) no cíclicos, en los cuales el grupo carbonilo (aldehído o cetona) del azúcar precursor es reducido al correspondientes alcohol primario o secundario. Debido a diferentes estructuras y estereoquímicas de los azúcares precursores, existen distintos polioles, tales como manitol (derivado de fructosa), sorbitol (de glucosa), galactitol (de galactosa), lactitol (de lactosa), maltitol (de maltosa) y eritritol (de eritrosa).

Los polioles ocurren naturalmente en frutas y verduras y son sintetizados por ciertas bacterias, levaduras, hongos filamentosos y algas. Su papel fisiológico es objeto de debate, pero se han propuesto como reservorios de carbono y poder reductor. También se ha sugerido un papel en la supervivencia de condiciones ambientales adversas tales como estrés osmótico y oxidante, como soluto compatible (mantenimiento de turgencia, y estabilización de lípidos y proteínas de membrana en baja actividad acuosa) y en la prevención de daño oxidante por eliminación de radicales libres de oxígeno reactivo.

D-manitol, también llamado manita o azúcar maná, el hexitol acíclico derivado de D-fructosa, es el poliol más abundante en la naturaleza, aún más que su C2-epímero sorbitol. El manitol se encuentra en el maná, exudados secos del fresno florido (Fraxinus ornus). En general, el manitol aparece en pequeñas cantidades en la mayoría de las frutas y verduras como calabaza, apio, cebolla, olivo y betabel; el muérdago y los micobiontes de liquen, así como algunas algas marinas como las algas cafés, también son ricos en manitol.

El manitol se encuentra comúnmente en el micelio de varios hongos y es un carbohidrato importante en los usualmente consumidos cuerpos de los hongos Agaricus bisporus y Lentinula edodes. El isómero óptico L-manitol no aparece en la naturaleza.

D-sorbitol, también llamado D-glucitol, el hexitol no cíclico derivado de D-glucosa, ocurre naturalmente en muchas frutas como bayas, cerezas, uvas, ciruelas, peras y manzanas, así como en algunas verduras. Adicionalmente, varias levaduras y bacterias son capaces de sintetizar sorbitol.

D-eritritol, el alcohol de azúcar de 4 carbonos, derivado del azúcar eritrosa, está naturalmente presente en frutas como uvas, peras y melones, así como en champiñones y algunos productos alimenticios fermentados como salsa de soya, sake y vino.

Manitol, sorbitol y eritritol han recibido el estatus de “generalmente reconocido como seguro” (Generally Recognized as Safe o GRAS) por la FDA. El mercado mundial de polioles es primariamente de sorbitol, mientras que manitol y eritritol representan un pequeño volumen.

 

Propiedades fisicoquímicas y aplicaciones

Los polioles se conocen principalmente por su poder edulcorante bajo en energía. Este poder edulcorante varía entre los diferentes alcoholes de azúcar: el dulzor relativo de manitol a sacarosa es 50-52 %, el de sorbitol a sacarosa es 60-70 % y el de eritritol a sacarosa es 53-70 %.

Manitol forma cristales blancos con temperatura de fusión de 165-168°C y su solubilidad es agua (18 % [m/v] a 25°C) es significativamente menor (4 veces) que la de sorbitol y la mayoría de los otros alcoholes de azúcar. La elevada entalpia positiva de la solución en agua da al manitol un sabor dulce fresco. Eritritol tiene la mayor entalpia de solución (191.3 J/Kg) de los tres alcoholes de azúcar, proporcionando un efecto refrescante substancialmente mayor. Manitol y eritritol cristalinos exhiben una higroscopicidad muy baja y son químicamente inertes.

Gracias a sus características fisicoquímicas, manitol tiene múltiples aplicaciones en las industrias alimentaria, farmacéutica, médica y química. La aplicación primaria del manitol es como aditivo alimenticio, referido como E421 en la Unión Europea. Se utiliza en productos alimenticios para dietas especiales, como goma de mascar libre de azúcar (no cariogénica)a, dulces y helados. Adicionalmente puede ser usado como agente texturizante, agente antiaglomerante o humectante. El manitol se emplea para reducir la tendencia de los azúcares a cristalizarse, incrementando así la vida fisicoquímica de anaquel en los productos alimenticios. En su forma cristalina, manitol muestra higroscopicidad y reactividad química muy bajas, así como excelentes propiedades térmicas y mecánicas. Se utiliza para preparar productos farmacéuticos como tabletas masticables y polvos granulados en altas humedades. Adicionalmente, su sabor dulce fresco enmascara el sabor poco placentero de ciertos medicamentos.

La principal aplicación del sorbitol es como aditivo alimentario (E420), especialmente en productos de confitería (gomas de mascar, dulces, postres y helados), alimentos para diabéticos y un amplio rango de otros productos alimenticios, no solamente como edulcorante sino también como humectante, texturizador y ablandador. Debido a su estabilización en agua y propiedades ablandadoras, el sorbitol es utilizado en la industria cosmética en cremas, emulsiones y lociones. Tanto el sorbitol como el manitol tienen un efecto estabilizador en alimentos, imitando parcialmente a la grasa. Otra importante propiedad de sorbitol es que aunque es higroscópico, tiende a adsorber o liberar agua muy lentamente; así, puede ser usado en alimentos para mantener las características fisicoquímicas iniciales de productos alimenticios frescos. Finalmente, sorbitol es el material inicial o bloque de construcción para la síntesis de ácido ascórbico (a través del proceso Reichstein), sorbosa y resinas alquidas, entre otros.

En medicina, el manitol ha encontrado aplicación como un poderoso diurético osmótico para terapia por intoxicación. Reduce el edema cerebral durante la cirugía y también es utilizado en reducción de la presión intraocular. Adicionalmente, es empleado en soluciones parenterales durante cirugía para prevenir la falla renal. El hexanitrato de manitol puede ser usado como vasodilatador en tratamientos para hipertensión. En la industria química, el manitol es usado en la producción de capacitores electrolíticos secos como un complejo con ácido bórico, y en la producción de resinas y surfactantes.

Los polioles son absorbidos más lentamente del tracto gastrointestinal que los azúcares comunes y no tienen efecto en el nivel sanguíneo de insulina. Este hecho, combinado con el poder edulcorante de estos compuestos, hace que los polioles sean interesantes como edulcorantes para los alimentos de personas diabéticas. Más aún, los polioles poseen un menos valor energético que la mayoría de los azúcares comunes (por ejemplo, manitol tiene 60 % menos calorías que la sacarosa). El reducido valor energético de los alcoholes de azúcar es resultado del hecho de que estos son solamente absorbidos parcialmente en el intestino delgado. Así, una porción substancial de los alcoholes de azúcar ingeridos alcanza el colon, en donde ciertas bacterias son capaces de degradarlos; esta degradación puede llevar a la producción de varios ácidos grasos de cadena corta en el colon, como butirato, el cual se ha identificado como protector contra el cáncer de colon.

Aunque estas propiedades hacen de manitol un candidato interesante para la elaboración de productos alimenticios light o reducidos en energía, el sobreconsumo puede derivar en incomodidad gastrointestinal debido a la producción de gas y diarrea. Manitol tiene el menor umbral laxante de los alcoholes de azúcar; por lo tanto, se recomienda que el consumo diario no exceda los 20 g.

Se ha demostrado que el consumo de sorbitol incrementa los niveles colónicos y cecales de butirato en ratas, mostrando la capacidad de este poliol para modificar la actividad de la microbiota intestinal, contribuyendo posiblemente a la salud de la mucosa colónica. Adicionalmente, se ha reportado que el sorbitol puede ser consumido como fuente de energía por algunas especies de Lactobacillus y Bifidobacterium, por lo que se ha sugerido que el sorbitol debe ser considerado como un prebiótico.

Eritritol tiene un espectro similar de aplicaciones a las de los otros alcoholes de azúcar. Una importante ventaja de eritritol sobre los otros alcoholes de azúcar es que posee el menor valor energético (0.2 Kcal/g). Adicionalmente, gracias a su baja masa molecular tiene la propiedad única de ser rápidamente absorbido en el intestino delgado, para ser excretado después por los riñones, haciéndolo no disponible para la fermentación colónica. Por lo tanto, su valor energético es aún más reducido y su respuesta glicémica es cero. Es apropiado para aplicaciones alimenticias para diabéticos o amigables con la dentadura. Como el xilitol, el eritritol puede reducir significativamente la bacteria de la caries Streptococcus mutans. La administración excesiva de eritritol no implica una amenaza por el desarrollo de incomodidad intestinal.

 

Producción química, enzimática y microbiana

La producción de manitol ocurre principalmente a través de procesos químicos, enzimáticos y biotecnológicos, pues la extracción a partir de materia prima vegetal ya no es económicamente viable. Actualmente, la producción industrial de manitol se realiza por hidrogenación catalítica de jarabes de fructosa, sacarosa o glucosa/fructosa. La producción a gran escala de manitol es principalmente realizada en lote en lugar de procesos continuos. La hidrogenación de mezclas glucosa/fructosa en solución acuosa es catalizada por níquel Raney a altas temperaturas (120-150°C) y presiones (70-140 atm). La selectividad del catalizador de níquel es tal que casi la mitad de la fructosa (ß-fructosa) es convertida a manitol y la otra mitad (α-fructosa) a sorbitol, mientras que la glucosa es exclusivamente reducida a sorbitol.

Así, la producción química comercial de manitol a partir de fructosa es siempre acompañada por la producción de sorbitol. De esta forma, la hidrogenación de solución 50/50 de fructosa/glucosa, rinde una mezcla 30/70 de manitol/sorbitol. Como la solubilidad de manitol es mucho menor que la de sorbitol, un proceso de cristalización fraccional de esta mezcla manitol/sorbitol eventualmente produce manitol puro.

La producción de manitol puede ser realizada enzimática o biotecnológicamente por fermentación microbiana. En el primer caso, la reducción de D-fructosa a D-manitol requiere una enzima manitol deshidrogenasa dependiente de NAD(P)H (MDH, EC 1.1.1.67).  Esta enzima ha sido purificada a partir de varios microorganismos, tales como Lactobacillus brevis, Lactobacillus sanfranciscensis, Saccharomyces cerevisiae, Rhodobacter sphaeroides, Torulaspora delbrueckii, Pseudomonas fluorescens y el alga roja de manglar Caloglossa leprieurii. La dependencia de MDH por un cofactor es la principal limitación de este proceso enzimático, pues NADH y especialmente NADPH son muy costosos, haciendo este proceso enzimático económicamente inviable.

Para contrarrestar este problema, otras estrategias, como la regeneración de cofactor por reacciones simultáneas, ha sido aplicada. Se ha sugerido la conversión simultánea de fructosa y formato, aplicando MDH y formato deshidrogenasa de una Pseudomonas fluorescens recombinante. Este proceso es ventajoso por varias razones: manitol es el único producto final formado; el formato es un reactivo económico; y el bióxido de carbono liberado durante la reacción de regeneración de cofactor no posee dificultades adicionales para el procesamiento posterior. El cofactor puede también ser regenerado en un sistema en donde una mezcla glucosa/fructosa es convertida en gluconato y manitol, utilizando glucosa deshidrogenasa y MDH. Adicionalmente, la manosa puede ser enzimáticamente reducida a manitol; sin embargo, la reacción reversible, la oxidación de manitol, es favorecida sobre la reducción de manosa.

Se ha descrito la producción enzimática de manitol puro a partir de fructosa utilizando MDH de P. fluorescens. Sin embargo, la hidrogenación enzimática por la producción de manitol es adversamente afectada por otros factores, como la retención de cofactores en el reactor con membranas especiales, la fuerte inhibición del producto al MDH y el elevado valor Km de MDH para fructosa. Finalmente, la combinación de procesos enzimáticos y químicos para la producción de manitol ha sido realizada, en la cual el rendimiento de manitol es incrementado cuando se compara con el rendimiento de sorbitol.

La producción de sorbitol es tradicionalmente realizada por hidrogenación catalítica de jarabe de D-glucosa a una concentración aproximada de 50 % (m/v). Un proceso enzimático para la producción de sorbitol ha sido propuesto, basado en la enzima glucosa-fructosa oxidoreductasa de Zymomonas mobilis, la cual permite la producción simultánea de ácido glucónico y sorbitol a partir de sacarosa. Adicionalmente, un sistema enzimático con reciclado de cofactor ha sido propuesto, basándose en las enzimas aldosa reductasa (de Candida tropicalis) y glucosa deshidrogenasa, en un bioreactor de membrana cargada.

El eritritol es principalmente producido biotecnológicamente a través de un proceso de fermentación con levaduras osmofílicas. Alternativamente, eritritol puede ser producido químicamente por reducción de ácido meso-tartárico u oxidación de 4,6-O-etilideno-D-glucosa. Adicionalmente, el eritritol puede ser producido por un proceso químico en donde el almidón dialdehido (dialdehido polimérico, obtenido por oxidación selectiva del almidón) es convertido a eritritol por una reacción química a alta temperatura en presencia de un catalizador de níquel.

Como una alternativa interesante para la producción química y enzimática, manitol, sorbitol y eritritol pueden ser sintetizados biotecnológicamente por fermentación microbiana. Las rutas biosintéticas ofrecen el potencial para una síntesis más segura y ambientalmente amigable, con especificidad mejorada del producto. Ciertas levaduras (S. cerevisiae), hongos filamentosos (Alternaria alternata y Aspergillus nidulans) y bacterias (Escherichia coli, Bacillus megaterium, Corynebacterium glutamicum y especialmente bacterias acidolácticas) han mostrado producir efectivamente manitol sin la coformación de sorbitol. Adicionalmente, estos microorganismos tienen la ventaja de regenerar los cofactores necesarios a través del catabolismo de azúcares.

De acuerdo a estudios descritos en la literatura, las bacterias acidolácticas (LAB) parecen ser los productores más potentes de manitol. Varios microorganismos han sido sugeridos como potenciales productores de sorbitol para procesos industriales, incluyendo varias cepas de levaduras y la bacteria productora de etanol Z. mobilis. La producción biotecnológica de eritritol es realizado por medio de un proceso de fermentación con levadura, usando levaduras osmofílicas pertenecientes a las especies Moniliella spp, Trigonopsis spp, Torulopsis spp y Candida magnolia, crecidos en almidones de trigo y maíz hidrolizados enzimáticamente. Aunque no se conocen cepas de LAB que produzcan naturalmente sorbitol, la ingeniería metabólica de algunas LAB se ha descrito como una alternativa interesante.

 

Microorganismos grado alimenticio en la producción de manitol, sorbitol y eritritol

Rutas metabólicas en LAB

LAB son microorganismos grado alimenticio (GRAS) que son usados extensivamente en la industria de alimentos fermentados, ya sea de manera espontánea o como cultivos iniciadores adicionados a los materiales crudos, debido a su capacidad acidificante y contribución a las propiedades organolépticas de los productos alimenticios finales. Adicionalmente, varias cepas LAB que presentan propiedades promotoras de la salud, han sido utilizadas por muchos años como probióticos en alimentos y para la producción de otros alimentos fermentados funcionales.

Tanto los cultivos iniciadores clásicos como los funcionales de cepas LAB están en uso. Los cultivos iniciadores clásicos contribuyen principalmente a la acidificación rápida de materias primas. Los cultivos iniciadores funcionales poseen al menos una propiedad funcional inherente, más allá de la producción de ácido láctico, que puede contribuir a la seguridad del alimento y/o una o más ventajas organolépticas, tecnológicas, nutricionales o de salud.

Las LAB han demostrado ser fábricas celulares ideales para la producción de varios nutracéuticos importantes a través de fermentación. Estos compuestos incluyen componentes que han probado ejercer efectos benéficos en la salud humana, tales como vitaminas del grupo B y alcoholes de azúcar bajos en energía. La biosíntesis de estos últimos compuestos por LAB hace de esta característica una combinación única de la característica GRAS de los polioles y el estatus de grado alimenticio de los microorganismos productores.

Dos rutas biosintéticas para manitol se han descrito en LAB, dependiendo de la ruta catabólica del carbohidrato utilizada: la fermentación homoláctica y la fermentación heteroláctica. En LAB homofermentadora, el flujo de carbono de los carbohidratos es dirigido principalmente a la producción de ácido láctico utilizando la ruta glicolítica; la formación de otros productos de fermentación es solamente posible cuando la producción de ácido láctico es restringida de alguna forma, creando así la necesidad para rutas regeneradoras de NADH.

La mayoría de las LAB homofermentadoras no producen manitol normalmente y la formación de este alcohol de azúcar es limitada en aquellas cepas cuya habilidad para regenerar NAD+ a través de la producción de ácido láctico está severamente afectada. Bajo dichas condiciones, la glicólisis también puede llevar a la fermentación ácido mixta, que da origen a productos finales como acetato, etanol, diacetilo, acetoina, 2,3-butanediol y, en algunos casos, manitol. Este cambio a la fermentación acido mixta es controlado por el flujo glicolítico a través del nivel de la enzima piruvato-formato ligasa. En estas cepas, manito-1-fosfato-deshidrogenasa (M1PDH, EC 1.1.1.17), que cataliza la reacción de reducción reversible de fructosa-6-fosfato a manitol-1-fosfato, y manitol-1-fosfatasa (M1Pase, EC 3.1.3.22), que cataliza la desfosforilación de manitol-1-fosfato a manitol, son las enzimas involucradas en la ruta de biosíntesis de manitol.

Aunque la secuencia del gen que codifica M1PDH (mtlD) ha sido reportada de la secuencia del genoma completo de la cepa homofermentadora Lactococcus lactis IL-403, la producción de manitol por L. lactis y otras LAB homofermentadoras no es muy común.  Sin embargo, la producción de manitol por L. lactis ha sido observada. En suspensiones de alta densidad de células en reposo de la cepa de L. lactis deficiente en lactato deshidrogenasa (LDH), elevados niveles de manitol son transitoriamente producidos y metabolizados una vez que la glucosa ha sido agotada. La formación de manitol intracelular es una consecuencia de la debilidad en la oxidación de NADH, causada por la actividad LDH altamente reducida de la cepa; la producción transitoria de manitol-1-fosfato sirve como una ruta para la regeneración de NAD+.

Adicionalmente, un mutante LDH-negativo de Lactobacillus plantarum produce pequeñas cantidades de manitol. En estos casos, la producción de manitol puede ser una ruta alternativa para la regeneración de NAD+ en lugar de la ruta usual a través de la formación de lactato. Otros autores han reportado la producción de manitol por cepas de Streptococcus mutans y Lactobacillus leichmannii, aunque a bajos niveles.

Por mucho, las mejores cepas LAB productoras de manitol son aquellas que exhiben metabolismo heterofermentador. Las LAB heterofermentadoras utilizan una combinación de rutas para el catabolismo carbohidrato. Cuando el microorganismo crece anaeróbicamente en glucosa, ácido láctico y normalmente etanol son producidos en cantidades equimolares, utilizando la ruta de pentosa fosfato. Así, el microorganismo mantiene el balance redox al convertir acetil-fosfato en etanol. Si un aceptor alternativo de electrón, como fructosa, está presente en el medio de crecimiento, el microorganismo es capaz de utilizarlo como tal. En el caso de fructosa, NAD(P)+ puede ser regenerado por una reducción de fructosa a manitol, resultando en la conversión de acetil-fosfato a acetato en lugar de la formación de etanol, con la producción concomitante de ATP. Esta producción suplementaria de ATP es la principal fuerza regidora detrás del uso de aceptores de electrones diferentes al acetil-fosfato. Las LAB heterofermentadoras producen manitol a partir de fructosa en una simple conversión enzimática por MDH, sin producción concomitante de sorbitol.

Se ha reportado la producción de manitol a partir de fructosa por una cepa de Lactobacillus spp; ahora es bien conocido que especies pertenecientes a los géneros Leuconostoc, Lactobacillus, Streptococcus y Oenococcus son capaces de sintetizar manitol. Adicionalmente, Leuconostoc mesenteroides y Leuconostoc pseudomesenteroides producen altos niveles de manitol en la presencia de fructosa o sacarosa.  El manitol se ha encontrado en concentraciones de hasta 150 g/l, lo cual es cercano a su límite de solubilidad (180 g/l a 25°C), indicando que no tiene efectos tóxicos en el organismo.

También se han reportado mutantes de L. pseudomesenteroides, obtenidos por mutagénesis, que muestran elevados rendimientos de manitol. Otras 2 especies LAB heterofermentadoras, Lactobacillus brevis y Lactobacillus buchneri, son capaces de producir manitol a partir de fructosa durante la fermentación de ensilaje. Otras cepas LAB productoras de manitol reportadas, incluyen las pertenecientes a diferentes especies de lactobacilos, como Lactobacillus brevis, L. buchneri, L. cellobiosus, L. fermentum, L. intermedius, Leuconostoc amelibiosum, L. citrovorum, L. mesenteroides subsp dextranicum y L. paramesenteroides. Finalmente, se ha encontrado que L. fermentum produce manitol durante los procesos de fermentación alimenticia, como en las fermentaciones del cacao y de la masa ácida.

En algunos casos, las LAB heterofermentadoras podrían resultar en la producción de eritritol, comenzando con el intermediario glicolítico intracelular fructosa-6-fosfato, el cual es dividido por una enzima fosfocetolasa en acetil-fosfato u eritrosa-4-fosfato, la cual es subsecuentemente reducida a eritritol. La producción de eritritol ha sido observada en Oenococcus oeni, Leuconostoc mesenteroides y Lactobacillus sanfranciscensis.

LAS no producen sorbitol de mantera natural. Solamente algunos microorganismos han sido sugeridos como productores de sorbitol, tales como levaduras y la bacteria Z. mobilis; esta última produce sorbitol utilizando la enzima glucosa-fructosa-oxidoreductasa (EC 1.1.99.28).

Como en el caso de la reducción de fructosa externa a manitol por MDH en LAB heterofermentadoras, reacciones similares pueden tener lugar en LAB homofermentadoras; por ejemplo, fructosa-6-fosfato puede ser reducida a manito-1-fosfato y sorbito-6-fosfato, los cuales son catalizados por M1PDH y sorbitol-6-fosfato-deshidrogenasa (S6PDH), respectivamente. Los genes que codifican estas enzimas están agrupados con el sistema fosfotransferasa dependiente de fosfoenolpiruvato del correspondiente transportador de hexitol, indicando que su papel fisiológico regular es probablemente la asimilación de hexitol más que la biosíntesis de hexitol. En Lactobacillus casei, una especie heterofermentadora facultativa, se han encontrado 2 genes codificadores para S6PDH (gutF y sorF) que podrían hacer posible la producción de sorbitol. Sin embargo, la producción de sorbitol por L. casei no ocurre cuando la especie crece en glucosa o lactosa, pues ambos genes para S6PDH están sujetos a la represión de catabolito de carbono e inducción de sustrato. Alternativamente, algunas cepas de Lactobacillus han sido utilizadas para producir sorbitol por diferentes acercamientos de ingeniería metabólica.

 

Procesos de fermentación para mejorar los rendimientos de manitol

Aunque varias especies de LAB producen manitol, solamente se ha reportado mejoras en el rendimiento en algunas cepas. La producción eficiente de manitol por LAB heterofermentadoras es con frecuencia lograda cuando se proporciona NADH por co-utilización de glucosa. Diversas condiciones de fermentación se han investigado para incrementar la producción de manitol por LAB.

Al evaluar los efectos de diferentes fuentes y concentraciones de carbono durante fermentaciones a pH controlado y lote alimentado, para mejorar la biosíntesis de manitol por la cepa Lactobacillus intermedius NRRL B-3693, la cepa produjo grandes cantidades de manitol a altas concentraciones de fructosa (300 g/l) como la única fuente de carbono, alcanzando valores de aproximadamente 200 g/l, lo cual excede el límite de solubilidad del manitol. Un tercio de la concentración de fructosa puede ser substituido por otros azúcares.

En otro reporte, LAB puede convertir fructosa casi cuantitativamente a manitol, cuando se utiliza glucosa como co-substrato. El uso de un proceso de fermentación por lote alimentado permite una considerable disminución en el tiempo de fermentación (de 136 a 92 h) para la producción de manitol por la cepa L. intermedius NRRL B-3693, aunque no se lograron mejoras en el rendimiento. Más recientemente, se reporta que al agregar sulfato de manganeso o sulfato de magnesio al medio de crecimiento, la producción y el rendimiento de manitol por la misma cepa son incrementados. Sin embargo, el rendimiento de manitol es incrementado en menor grado con sulfato de magnesio que con sulfato de manganeso.

Hace más de una década se desarrolló y optimizó un proceso de fermentación para manitol, con una cepa de Leuconostoc mesenteroides en condiciones de pH constante, 20°C y agitación lenta. La eficiencia de conversión de fructosa a manitol está por arriba del 90 % utilizando una mezcla de glucosa y fructosa en una relación 1:2; la fermentación es completada después de 65 h. La recuperación de manitol es realizada a partir de un medio de fermentación libre de células, por concentración y cristalización a 0-5°C, logrando una pureza de manitol superior al 99 %. Adicionalmente, se han reportado experimentos con producción continua de manitol en un reactor de flujo continuo (plug-flow reactor o PFR, por sus siglas en inglés) con L. mesenteroides inmovilizado en espuma de poliuretano, llevando a un incremento de 5 tantos en la productividad volumétrica (8g/l/h) comparado con las fermentaciones en lote, pero la eficiencia de conversión es menor (60 %, contra 76 % de la fermentación en lote).

Las células en reposo de varias cepas LAB heterofermentadoras han sido evaluadas para su habilidad para producir manitol a partir de fructosa. L. mesenteroides ATCC 9235 produjo altas cantidades de manitol, utilizando cultivos de reciclado celular en membrana de alta densidad celular. Fueron logrados una alta productividad volumétrica de manitol (26.2 g/l/h) y rendimiento (97 % mol). Utilizando la misma biomasa inicial, se ha logrado una producción de manitol estable de alto nivel por 14 lotes de bioconversión sucesivos. Incrementando la concentración inicial de fructosa de 100 a 120 g/l y luego a 140 g/l, resulta en menores productividades, debido tanto a inhibición de sustrato como de producto final de la enzima clave MDH.

Varias enzimas MDH han sido purificadas y caracterizadas a partir de diferentes especies LAB, tales como Lactobacillus brevis, Lactobacillus intermedius, Leuconostoc mesenteroides y Lactobacillus sanfranciscensis. L. sanfranciscensis LTH2590, una cepa perteneciente a la microbiota de masas ácidas de trigo y centeno preparadas tradicionalmente, exhiben biosíntesis de manitol (hasta 60 g/l) a partir de fructosa, utilizando un proceso de lote alimentado, en un medio simple de extracto de salvado, suplementado con una mezcla comercial fructosa/glucosa.

La producción de manitol por una enzima purificada a partir de L. sanfranciscensis podría ser una mejora significativa sobre el método de producción química. La MDH aislada de L. sanfranciscensis TMW1.392 (isogénica a la cepa LTH2590) ha sido purificada y caracterizada. Adicionalmente, se ha aislada y purificada la MDH de Lactobacillus intermedius NRRL B-3693, enzima que muestra una alta afinidad para NADPH por reducción de fructosa, exhibiendo una especificidad de sustrato muy elevada, capaz de convertir fructosa a manitol con un rendimiento del 100 %. Estos resultados sugieren que la enzima aislada tiene potencial para el uso en la biosíntesis libre de células de manitol a partir de fructosa.

 

Aumento de escala para la producción de manitol por LAB

Se han obtenido buenos rendimientos de manitol a partir de materias primas ricas en azúcares con levaduras y hongos. Sin embargo, las productividades volumétricas son bajas (2 g/l/h). Otra desventaja de estos microorganismos es los prolongados tiempos de cultivo requeridos, lo que puede incrementar el riesgo de contaminación y los costos de producción. En contraste, las LAB puede producir eficientemente manitol a partir de fructosa con productividades volumétricas de manitol cercanas a 10 g/l/h, lo que puede alcanzarse tanto en cultivos en lote como en lote alimentado. Más aún, se han alcanzado productividades volumétricas de manitol por arriba de 20 g/l/h con LAB, al incrementar la concentración de biomasa. Sin embargo, cuando se produce manitol con LAB, aproximadamente 0.5 ml adicionales de fructosa (o glucosa) por mol de fructosa consumida para la producción de manitol, es requerida para la regeneración de NAD(P)+. Así, el máximo rendimiento teórico de manitol a partir de azúcar total es 66.7 %.

Por lo anterior, se ha evaluado la escalabilidad de un nuevo bioproceso para la producción de manitol por una cepa de Leuconostoc mesenteroides probada a escala piloto. Los niveles de producción alcanzados fueron similares a aquellos obtenidos en ensayos preliminares de laboratorio, obteniendo cristales de manitol de alta pureza con valores de rendimiento similares. El nuevo bioproceso consiste de bioconversión semicontinua con producción eficiente de alto rendimiento de manitol a partir de fructosa, con buenos rendimientos de cristalización utilizando un procesamiento simple. Los niveles de producción alcanzados en este estudio fueron comparables con aquellos de los procesos de hidrogenación catalítica.

Las ventajas de este bioproceso incluyen los bajos costos de materia prima, un rendimiento mejorado de manitol a partir de fructosa y otros azúcares, el hecho de que la adición de gases al reactor no es necesaria (el gas hidrógeno debe ser agregado en el proceso catalítico), protocolos de purificación simplificados y la formación de menos subproductos por unidad de manitol cristalino producido. Adicionalmente, Leuconostoc mesenteroides es una especie de LAB comúnmente utilizada y aceptada en la industria alimentaria.

 

Ingeniería metabólica para la producción de manitol, sorbitol y eritritol

Los acercamientos biotecnológicos para incrementar la producción de alcohol de azúcar incluyen modificaciones como mutantes deficientes en lactato deshidrogenasa (Lactobacillus fermentum, L. plantarum, L. lactis y L. casei), D-sorbitol-6-fosfato-deshidrogenasa recombinante (L. casei), xilosa reductasa y transportador de xilosa recombinante (L. lactis) y sobre-expresión de manitol-1-fosfato-deshidrogenasa (L. lactis), entre otros.

Como ya se ha descrito, la biosíntesis de manitol no es una característica común entre cepas de LAB homofermentadoras. Sin embargo, se ha encontrado que un mutante LDH-negativo de Lactobacillus plantarum, una especie LAB frecuentemente encontrada en varios alimentos fermentados y en el tracto gastrointestinal de los mamíferos, produce pequeñas cantidades de manitol a partir de glucosa, a diferencia de su cepa silvestre, la cual no es capaz de producir manitol a partir del mismo carbohidrato.

Adicionalmente, una alta producción intracelular de manitol se ha observado en un mutante LDH-deficiente de Lactobacillus lactis. Esta cepa muestra acumulación transitoria de altas cantidades de manitol intracelular (hasta 90 mM) y manitol-1-fosfato (hasta 80 mM) en sucesión, siendo metabolizado el manitol después del agotamiento de glucosa.

La habilidad demostrada para producir manitol por cepas deficientes en LDH, ha sido utilizada como una herramienta para incrementar la producción de manitol por cepas LAB homofermentadoras modificadas por ingeniería metabólica. Para obtener una cepa efectiva en la producción de manitol, el sistema de transporte de manitol de una cepa LDH es interrumpido; esta estrategia de ingeniería lleva a la construcción de cepas de L. lactis que son capaces de producir manitol con altos rendimientos (33 %) a partir de glucosa.

Se ha encontrado que la inactivación del gen ldhL en una cepa de L. casei produce un desbalance en los niveles de NADH, derivando en la activación de otras rutas catabólicas capaces de regenerar NAD+ sin disminuir drásticamente la producción de lactato. Además de lactato, el mutante ldhL produce piruvato, acetato, acetoina, etanol, manitol y diacetilo. Así, en ausencia de dicho ldh, el piruvato puede ser canalizado principalmente a través de las rutas de α-acetolactato-sintetasa, piruvato-formato-ligasa y piruvato-oxidasa. Por lo tanto, el metabolismo de piruvato ha sido reenrutado, esencialmente como en otras LAB  deterioradas en el gen ldh.

Se ha diseñado un acercamiento diferente de ingeniería metabólica para sobre-expresar un gen de manitol-1-fosfato-deshidrogenasa (mtlD) de una cepa de Lactobacillus plantarum en una cepa láctea de Lactobacillus lactis. Células en reposo del transformante deficiente el LDH fueron capaces de convertir 25 % de glucosa en manitol, el cual no fue utilizado luego del agotamiento de glucosa.

Se han construido diferentes cepas mutantes (por eliminación de genes D-LDH y L-LDH, ldhD o ldhD-ldhL, respectivamente) de una cepa de Lactobacillus fermentum para producir ya sea manitol y ácido láctico puro, o piruvato en un solo proceso. Así, además de producir manitol, L-lactato o piruvato, substratos valiosos para preparar biopolímeros sintéticos y farmacéuticos fueron sintetizados. La cepa mutante sencilla produjo manitol y ácido L-láctico, mostrando rendimientos y productividades similares a aquellos de la cepa madre. La cepa mutante doble produjo manitol y piruvato, pero la producción de manitol fue menor, aunque se mantuve un alto rendimiento de manitol.

La ingeniería metabólica hacia la producción de sorbitol permitió integrar el gen codificador para D-sorbitol-6-fosfato-deshidrogenasa (gutF) en el operón de lactosa de una cepa de Lactobacillus casei, siguiendo la misma regulación de los genes lac; las células en reposo de esta cepa recombinante son capaces de sintetizar sorbitol a partir de glucosa, si son pre-crecidos en lactosa. La inactivación del gen ldhL incrementó la producción de sorbitol, sugiriendo que la ruta modificada proporcionó una ruta alternativa para la regeneración de NAD+.

La capacidad de la cepa de L. plantarum para producir sorbitol a partir de fructosa-6-fosfato, por reversión de la ruta catabólica de sorbitol en una cepa mutante deficiente para las actividades L-LDH y D-LDH ha sido estudiada. Las células en reposo bajo control de pH con glucosa como sustrato, muestran un re-enrutamiento del flujo de fructosa-6-fosfato hacia la producción de sorbitol, lo que rinde una eficiencia de 65 % en re-enrutamiento de azúcar hacia la biosíntesis de sorbitol; adicionalmente, ocurrió producción de manito, aunque a menores niveles (de 9 % a 13 % de conversión de glucosa) comparada con la cepa de control.

Estos hallazgos indican competencia por re-enrutamiento de fructosa-6-fosfato por la M1PDH expresada nativamente. Menores niveles (25 %) de re-enrutamiento de azúcar hacia sorbitol se obtuvieron utilizando células creciendo activamente en lugar de células en reposo. Los resultados indican que las cepas recombinantes de L. plantarum son microorganismos candidatos prometedores para la producción de sorbitol.

A la fecha, la única evidencia de producción de xilitol por LAB ha sido lograda por expresión de D-xilosa-reductasa de la levadura Pichia stipitis CBS 5773 y el transportador de xilosa de Lactobacillus brevis ATCC 8287, en la cepa Lactobacillus lactis NZ9800. La producción de xilosa, de gran interés en el mercado de polioles, fue realizada utilizando cultivo con alta densidad celular de células recombinantes sin crecimiento bajo condiciones microaerófilas, en presencia de xilosa y glucosa. El rendimiento de xilitol a partir de xilosa fue 1.0 mol/mol, y la relación de xilitol producido por glucosa consumida fue 2.5 mol/mol. La productividad volumétrica es 2.72 g/l/h después de 20 h. Alrededor del 34 % de la xilosa presente inicialmente fue consumido.

El cambio de fermentación homoláctica a ácido mixta en una etapa temprana del experimento se observó en la cepa recombinante. Este nuevo acercamiento muestra que LAB podrían ser también candidatos prometedores para la eficiente producción de xilitol.

Hasta hora, no se han hecho esfuerzos serios para incrementar la producción de eritritol por LAB a través de ingeniería metabólica. Sin embargo, cuando se considera la naturaleza grado alimenticio de estos microorganismos, la utilidad de dicho acercamiento es evidente.

 

La demanda creciente de los consumidores por productos alimenticios que sean no solamente seguros y de alta calidad, sino también benéficos para la salud de una forma u otra, ha llevado a la industria de los alimentos funcionales a proporcionar esto mediante el agregado de atributos específicos que promocionan la salud intestinal (probióticos y prebióticos) y reducen el riesgo de cáncer (antioxidantes), enfermedad coronaria (anti-aterogénicos) y diabetes (substitutos de azúcar). Además de lo anterior, un número cada día mayor de personas vive con enfermedades crónicas debilitantes, usualmente relacionadas a la edad, como diabetes, que requieren una atención nutricional específica.

Las aplicaciones potenciales de los alcoholes de azúcar en la industria alimentaria son numerosas y variadas, no solamente debido a sus propiedades fisicoquímicas sino también por sus características promotoras de la salud. Por tanto, además de servir como edulcorantes no nutritivos, los alcoholes de azúcar pueden también actuar como prebióticos.

Muchas cepas LAB han mostrado ser fábricas celulares ideales para la producción de importantes nutracéuticos. El desarrollo de productos alimenticios fermentados, enriquecidos naturalmente en manitol a través de producción in situ por LAB debería ser altamente benéfico y puede llevar a novedosos alimentos fermentados con valores nutritivos mayores.

Aunque muchas LAB sintetizan manitol de manera natural, las estrategias de modificación genética ayudan a mejorar su producción y, en el caso de sorbitol, inducir su biosíntesis. Los procesos biotecnológicos que utilizan microorganismos para estos azúcares bajos en energía son comercialmente viables en la actualidad. Sin duda, habrá de realizarse mayor progreso en la producción de estos azúcares bajos en energía por LAB, así como la introducción concomitante de productos alimenticios enriquecidos con polioles en el mercado del futuro cercano.